Klonogene Test: adhärenter Zellen
Summary
Die Anwendbarkeit des klonogene Test zur Bewertung der reproduktiven Überlebensfähigkeit seit mehr als 50 Jahren etabliert. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zellen.
Abstract
Die klonogenen (oder koloniebildende)-Assay wurde für mehr als 50 Jahren besteht; die ursprüngliche Papier beschreibt die Technik wurde in 1956 1 veröffentlicht. Abgesehen von der Dokumentation der Methode erzielte das erste Meilenstein-Studie die erste Strahlung Dosis-Wirkungs-Kurve für X-ray bestrahlt Säugetieren (HeLa) Zellen in Kultur 1. Grundsätzlich ermöglicht die klonogene Test eine Bewertung der Unterschiede in der reproduktiven Lebensfähigkeit (Kapazität der Zellen auf die Nachkommen zu produzieren, dh eine einzelne Zelle, um eine Kolonie von 50 oder mehr Zellen zu bilden) zwischen Kontrolle unbehandelte Zellen und Zellen, die verschiedene Behandlungen wie Belichtung unterzogen haben auf ionisierende Strahlung, verschiedene chemische Verbindungen (zB Zytostatika) oder in anderen Fällen genetische Manipulation. Der Test hat sich die am weitesten akzeptierte Methode in der Strahlenbiologie und wurde vielfach zur Beurteilung der Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien verwendet. Weiterhin ist die klonogenen allgemein zur Überwachung der Wirksamkeit von Strahlung modifizierende Verbindungen und zur Bestimmung der Wirkung von Zytostatika und anderen Anti-Krebs-Therapeutika auf Basis der Kolonie-bildende Fähigkeit, in verschiedene Zelllinien verwendet. Ein typisches klonogenen Überleben Experiment mit adhärenten Zellen Zeilen umfasst drei Komponenten, 1) Behandlung der Zellrasen in Zellkulturflaschen, 2) Vorbereitung der einzelnen Zellsuspensionen und Beschichtung eine entsprechende Anzahl von Zellen in Petrischalen und 3) Fixierung und Färbung Kolonien nach einer entsprechenden Inkubationszeit könnte, die von 1-3 Wochen liegen, je nach Zelllinie. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zelllinien mit dem Einsatz von einer immortalisierten humanen Keratinozyten-Zelllinie (FEP-1811) 2. Auch sind unsere Ziele zu gemeinsamen Merkmale der klonogenen Assays einschließlich Berechnung der Platierungseffizienz und Überleben Fraktionen nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung zu beschreiben, und Änderungen der Strahlung-Response mit dem Einsatz von ein natürliches Antioxidans Formulierung zu veranschaulichen.
Protocol
Discussion
In diesem Beispiel menschliche FEP-1811 Keratinozyten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von bis zu 100 pg / mL CPF behandelt; Daten werden für 20 ug / mL CPF für 1 Stunde bei 37 ° C gezeigt Nach der Behandlung wurden die Zellen mit 4 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min Gammacell 1000 Elite Strahler) bestrahlt. Für die Kontrolle unbehandelt und Drogen nur Behandlungen 100 Zellen wurden in jeder Petrischale und 1000 Zellen pro Schale wurden die bestrahlten Pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. HR wird von einer australischen Post-Graduate-und BakerIDI hellen Funken Auszeichnungen unterstützt. Diese Arbeit wird durch die CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), gegründet und unterstützt unter der australischen Regierung Cooperative Research Centres-Programm finanziert. CO ist der Empfänger einer australischen Post-Graduate-Award und eine CRC-BID zusätzlichen Stipendium.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
