クローン原性アッセイ：付着細胞
Summary
生殖可能性を評価するためのクローン原性アッセイの適用は50年以上のために設立されました。ここでは、接着細胞とクローン原性アッセイを行うための一般的な手順を示しています。
Abstract
クローン原性（またはコロニー形成）アッセイは、50年以上のために設立されました。テクニックを記述したオリジナルの論文は1956年1に掲載されました。離れて方法を文書化するから、最初の画期的な研究は、培養1のX線照射した哺乳類（HeLa細胞）細胞の最初の放射線線量応答曲線を生成する。 control未処理の細胞とそのような暴露などの様々な治療を受けた細胞の間で、基本的に、クローン原性アッセイは、生殖生存率の違い（50以上の細胞のコロニーを形成する単一のセル、すなわち子孫を生成する細胞の能力）のアセスメントが可能に電離放射線、様々な化学化合物（例えば、細胞毒性薬）や他の場合における遺伝子操作へ。アッセイは、放射線生物学で最も広く受け入れられている技術となっていると広く異なる細胞株の放射線感受性を評価するために使用されています。さらに、クローン原性アッセイは、一般的に化合物を変更する放射線の有効性を監視するために、異なる細胞株のコロニー形成能力、に細胞毒性薬と他の抗がん治療薬の効果を決定するために使用されます。接着細胞株を使用する典型的なクローン原性生存実験ではコロニーを固定し、染色つの異なるコンポーネントが、1）組織培養フラスコで細胞単層の治療、2）単一の細胞懸濁液の調製とペトリ皿と3に適切な数の細胞をプレーティング）を含む関連する潜伏期間の後、これは細胞株によっては、1〜3週間から範囲にすることができます。ここでは、不死化したヒトケラチノサイト細胞株（FEP – 1811）2の使用で接着性細胞株をクローン原性アッセイを行うための一般的な手順を示しています。また、私たちの目的は、放射線に対する細胞の曝露後のコロニー形成率と生存率の分数の計算を含むクローン原性アッセイの共通の特徴を記述するために、そして天然の抗酸化製剤の使用と放射線応答の変更を例示することがあります。
Protocol
Discussion
この例では、人間のFEP – 1811ケラチノサイトは、最大100μg/ mLのCPFへの種々の濃度で処理した、データは37℃で1時間に20μg/ mLのCPF℃であるために示されています治療後の細胞は、137 Csのソース（; Nordionインターナショナル、カナダ、ON、1.6 Gyの/分Gammacell 1000年エリート照射器）を使用して、4 Gyで照射した。制御のために未処理と薬剤のみの治療法100個の細胞は、それぞれのペトリ皿に播…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 HRは、オーストラリアの大学院とBakerIDI明るい火花の賞でサポートされています。この作品は、オーストラリア政府の共同研究センタープログラムの下で設立された、サポートされている医学開発株式会社（CRC – BID）、のためのCRCによって運営されている。 COは、オーストラリアの大学院賞とCRC – BIDの補足奨学金受取人です。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI-Chem | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
