마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제
Summary
마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.
Abstract
testis의 세포 유형의 이질적인 성격과 meiotic 세포 배양 모델의 부재는 감수 분열 동안 매니 페스트의 독특한 차별화 프로그램의 연구에 상당한 장애물을하고 있습니다. elutriation 또는 Staput (침전) BSA 및 / 또는 percoll 그라디언트를 사용하는 두 가지 주요 방법은, 다양한 도로, 성인 및 미숙 동물 모두에서 다양한 meiotic 분수를 정화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법 중 두 세포 크기와 세포 meiotic에게 1-5 분리 밀도에 의존하고 있습니다. 전반적으로, 몇 가지 세포 인구 6 제외하고, 이러한 프로토콜 자세한 분자 분석을 위해 필요한 수많은 meiotic 세포 집단의 충분한 순도를 얻을하지. 또한, 같은 방법으로 meiotic 세포의 보통 한 종류는 meiotic 세포 샘플을 비교했을 때 재현성과 균질성에 관한 복잡한 여분 수준을 추가 주어진 시간에서 정화 수 있습니다.
여기, 우리는 Hoechst 33342 얼룩 7,8와 함께 외과를 사용하여 배아 세포에서 라운드 spermatids로, 하나는 쉽게 시각화 식별하고, meiotic 세포를 정화 수있는 세련된 방법을 설명합니다. 이 방법은 전체 meiotic 프로세스의 전반적인 스냅샷을 제공하며 하나는 높은 감수 분열 대부분의 단계에서 가능한 세포를 정화 수 있습니다. 이러한 정화 전지는 다음 meiotic 재조합 11 핫스팟에서 예제 유전자 발현 9,10의 변화와 nucleosome 인의 역학에 대해, 세포의 감수 분열을 통해 진행을 수반하는 분자 변경 사항을 자세하게 분석할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시 프로토콜 사람이 동시에 조사이 근본적인 프로세스의 역학을 연구 수 있도록, 성인 남자 생쥐에서 매우 높은 순도로 meiotic 무대 세포의 전체 범위를 정화 수 있습니다. 정화 세포는 RNA 추출 9,10, nucleosome 매핑 11, 재조합 분자 탐지, 단백질 분석, 그리고 많은 이르기까지 다양한 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다. 그러나, 검출 방법은 정화 meiotic 세포의 금액에 적응?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 플로리다 주에서 스크립스 및 보너스 번호는 각각 종합 의료 과학 국립 연구소와 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소에서 R01GM085079 및 R21HD061304에 돈도에 의해 부분적으로 지원되었다. 이것은 스크립스 연구소의 논문 번호는 20917입니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
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