마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
testis의 세포 유형의 이질적인 성격과 meiotic 세포 배양 모델의 부재는 감수 분열 동안 매니 페스트의 독특한 차별화 프로그램의 연구에 상당한 장애물을하고 있습니다. elutriation 또는 Staput (침전) BSA 및 / 또는 percoll 그라디언트를 사용하는 두 가지 주요 방법은, 다양한 도로, 성인 및 미숙 동물 모두에서 다양한 meiotic 분수를 정화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법 중 두 세포 크기와 세포 meiotic에게 1-5 분리 밀도에 의존하고 있습니다. 전반적으로, 몇 가지 세포 인구 6 제외하고, 이러한 프로토콜 자세한 분자 분석을 위해 필요한 수많은 meiotic 세포 집단의 충분한 순도를 얻을하지. 또한, 같은 방법으로 meiotic 세포의 보통 한 종류는 meiotic 세포 샘플을 비교했을 때 재현성과 균질성에 관한 복잡한 여분 수준을 추가 주어진 시간에서 정화 수 있습니다.
여기, 우리는 Hoechst 33342 얼룩 7,8와 함께 외과를 사용하여 배아 세포에서 라운드 spermatids로, 하나는 쉽게 시각화 식별하고, meiotic 세포를 정화 수있는 세련된 방법을 설명합니다. 이 방법은 전체 meiotic 프로세스의 전반적인 스냅샷을 제공하며 하나는 높은 감수 분열 대부분의 단계에서 가능한 세포를 정화 수 있습니다. 이러한 정화 전지는 다음 meiotic 재조합 11 핫스팟에서 예제 유전자 발현 9,10의 변화와 nucleosome 인의 역학에 대해, 세포의 감수 분열을 통해 진행을 수반하는 분자 변경 사항을 자세하게 분석할 수 있습니다.
프로토콜
이 프로토콜은 두 가지 주요 단계로 분리 수 있습니다 : 필요한 경우 (1) 마우스 testis 세포의 분리와 Hoechst 33342 얼룩이에 의해 배아 세포부터, 감수 분열의 모든 단계를 포함하여 관련 meiotic 분수의 정렬 (2) 외과를 따라 라운드 spermatids. 일단 수집이 매우 풍부한 meiotic 인구는 분석의 광범위한 사용하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 하나의 성인 testis의 분리를 설명, 볼륨 아동 또는 추가 testes에 대해 적절하게 적용할 수 있습니다.
1. Testis 분리
- 15 - ML 튜브에 놓으 decapsulated testis합니다.
- Collagenase 유형 I. 120 U / ML을 포함 Gey의 밸런스 소금 솔루션 3 - ML (GBSS)를 추가
- DNAse I (50 % 글리세롤의 1mg/ml 주식 솔루션) 10 μl를 추가하고 교제를 끊다 시작 고환 tubules가 나타날 때까지 손으로 적극적으로 그것을 흔들어.
- 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동
- 실온에서 수직으로 1 분 가만히 따르다 및 뜨는 폐기.
- 1.5 단계 1.2를 반복합니다.
- Co....
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토론
여기에 제시 프로토콜 사람이 동시에 조사이 근본적인 프로세스의 역학을 연구 수 있도록, 성인 남자 생쥐에서 매우 높은 순도로 meiotic 무대 세포의 전체 범위를 정화 수 있습니다. 정화 세포는 RNA 추출 9,10, nucleosome 매핑 11, 재조합 분자 탐지, 단백질 분석, 그리고 많은 이르기까지 다양한 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다. 그러나, 검출 방법은 정화 meiotic 세포의 금액에 적응해야합니다. 또한,이 방법의 높은 재현성과 함께, 그것은 특정 실험에 필요한 재료의 양을 증가하기 위해 다른 일에서 수행 같은 분수의 수영장 여러 독립적인 종류의 수 있습니다. 또한이 방법은 하나가 빠른 속도로 유전자 녹아웃, 발달 진행 수차, 또는 세포의 감수 분열에 영향을 목적으로 특정 치료의 효과 (예, 방사선 조사의 효과를 평가할 수있는 전체 meiotic 프로세스의 독특한 시각적 표현과 함께 조사를 제공하거나, 작은 분자 억제제 치료).
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 플로리다 주에서 스크립스 및 보너스 번호는 각각 종합 의료 과학 국립 연구소와 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소에서 R01GM085079 및 R21HD061304에 돈도에 의해 부분적으로 지원되었다. 이것은 스크립스 연구소의 논문 번호는 20917입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | GBSS에 12,000U/ml로 용해하여 4°C에서 보관 |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | 1mM HCl에 50mg/ml로 용해하여 4°C에서 보관 |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | 포화 용액 (DMSO에 10mg/ml, 4°C에서 보관) |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | 물/50% glycerol에 1mg/ml로 용해하여 -20°C에서 보관 |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
참고문헌
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L.
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재인쇄 및 허가
