مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة
Summary
نحن يبرهن على وجود مناعي لونين (CHIP) طريقة لتحديد التفاعلات عامل في جينات محددة الأنسجة أثناء أو بعد ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني في الأنسجة الجنينية الماوس. هذا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع بروتوكول لدراسة تفعيل الجين الأنسجة محددة كما يحدث أثناء التطور الجنيني الطبيعي.
Abstract
الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة قوية لتحديد البروتين : التفاعلات التي تحدث لونين في سياق الخلايا الحية 1-3. وقد تم استغلال هذه التقنية على نطاق واسع في خلايا الأنسجة ، وإلى حد أقل ، في النسيج الأساسي. معقد تطبيق الشذرة في الأنسجة الجنينية القوارض ، وخصوصا في أوقات مبكرة من التنمية ، من كمية محدودة من الأنسجة والخلايا وعدم تجانس أنواع الأنسجة في الجنين. هنا نقدم وسيلة لتنفيذ الشذرة به يوميا نأت الجنينية 8.5 (E8.5) الجنين. ويمكن تقسيم المنفصمة لونين من جنين واحد إلى E8.5 تصل إلى خمس aliquots ، والذي يسمح للمحقق مادة كافية لعناصر والتحقيق للبروتين معين : التفاعلات لونين.
وقد استخدمت هذه التقنية لأننا نبدأ في الوثيقة البروتين : التفاعلات ونين خلال مواصفات الأنسجة برامج محددة التعبير الجيني. عدم تجانس أنواع الخلايا في الجنين يقيد بالضرورة تطبيق هذا الأسلوب لأن النتيجة هي الكشف عن البروتين : التفاعلات ونين دون تمييز ما إذا كانت التفاعلات تحدث في كل شيء ، مجموعة فرعية من ، أو نوع خلية واحدة (ق). ومع ذلك ، وفحص الأنسجة محددة الجينات أثناء أو في أعقاب ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني هو ممكن لسببين. أولا ، مناعي من العوامل المحددة الأنسجة المعزولة بالضرورة لونين من نوع الخلية حيث يتم التعبير عن عامل. الثانية ، لا ينبغي للمناعي coactivators histones والتي تحتوي على بعد متعدية التعديلات التي ترتبط مع تنشيط الجينات يمكن العثور على الجينات وتسلسل الجينات التنظيمية في نوع من الخلايا الجينات حيث يجري أو قد تم تفعيلها. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق تقنية لدراسة معظم أنسجة محددة الأحداث التنشيط الجيني.
نحن المستخدمة في المثال المبين أدناه ، وE8.5 E9.5 أجنة الفئران لدراسة عامل ملزم في جين معين المروج العضلات والهيكل العظمي. Somites ، وهي الأنسجة التي السلائف من عضلات الهيكل العظمي من الجذع والأطراف وشكل ، وموجودة في E8.5 9.5 – 4،5. Myogenin عامل التنظيمية اللازمة لتمايز الهيكل العظمي والعضلات 6-9. بيانات تثبت أن يترافق مع المروج myogenin الخاصة في E8.5 E9.5 والأجنة. لأن يعبر فقط myogenin في somites في هذه المرحلة من التنمية 6،10 ، وتشير البيانات إلى أن التفاعلات مع المروج myogenin الخاصة بها قد حدثت بالفعل في الهيكل العظمي خلايا العضلات في السلائف E8.5 الأجنة.
Protocol
Discussion
الشذرة في البروتوكول وصفها ، نظهر أن يرتبط myogenin منظم عضلي مع المروج myogenin في الأنسجة العضلية الهيكلية موجودة في E8.5 السلائف واحد والأجنة E9.5. لقد تميزت الدراسات السابقة على نطاق واسع myogenin ملزمة لمربع البريد التي تحتوي على متواليات ، بدءا من التجارب الأولية في المختبر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 GM56244 لاعلام ، والذي يتضمن منح الأموال من خلال الأميركي لإنعاش الاقتصاد وإعادة الاستثمار قانون عام 2009 ، والمعاهد الوطنية للصحة في R01 GM87130 JARP
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
