Summary
Este artigo descreve uma abordagem experimental para a regulação dinâmica de interações célula-célula entre células aderentes em escala micrométrica. Manipulação da comunicação intercelular entre hepatócitos e células do estroma é demonstrada. A plataforma desenvolvida permite a investigação de interações célula-célula em uma variedade de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento e patogênese.
Abstract
O papel do microambiente celular é reconhecida como crucial para determinar o destino da célula e função em praticamente todos os tecidos de mamíferos de desenvolvimento para transformação maligna. Em particular, a interação com estroma vizinho tem sido implicado em uma infinidade de fenômenos biológicos, no entanto, as técnicas convencionais limitar a capacidade de interrogar os elementos espaciais e dinâmica de tais interações.
Em Cultura Reconfigurável micromecânico (RC), que empregam um substrato de silício microusinados com partes móveis para controlar dinamicamente interações célula-célula através de reposicionamento mecânica. Anteriormente, este método tem sido aplicado para investigar comunicação intercelular em co-culturas de hepatócitos e células não-parenquimatosas, demonstrando interações dependentes do tempo e uma gama limitada de sinalização solúvel 1.
Aqui, descrevemos em detalhes a preparação e utilização do sistema RC. Começamos por demonstrar a movimentação das partes do dispositivo usando uma pinça, inclusive atuando entre a abertura e configurações de contacto (populações de células separadas por um intervalo de 80 mM estreito, ou em contato íntimo direta). Em seguida, detalhamos o processo de preparação dos substratos para a cultura, eo multi-etapa do processo de semeadura de células necessárias para a obtenção de monocamadas de células confluentes. Usando a microscopia ao vivo, nós então ilustrar tempo real manipulação de células entre as diferentes possíveis configurações experimentais. Finalmente, demonstrar os passos necessários, a fim de regenerar a superfície do dispositivo para reutilização: tolueno e limpeza piranha, revestimento de isopor, e tratamento de plasma de oxigênio.
Protocol
Preparação de culturas de células:
- Comece com peças de silício revestido com plasma tratado com poliestireno.
- Revestimento com peças apropriadas proteínas da matriz extracelular para suporte de fixação do tipo de célula desejada. Para hepatócitos, incubar em 50 g / ml Colágeno-1 solução a 37 ° C por 45 min. Para fibroblastos 3T3, nenhuma matriz é necessário.
- Bloqueio peças com partes complementares na configuração de contato.
- Mergulhe em álcool 70% para um mínimo de 10 min para esterilizar. Lave 2x em DDH 2 O, e 1x em meios de cultura celular.
- Células de semente em uma concentração de 500.000 células / ml no meio de cultura apropriado. Use 1 ml em cada poço de uma placa de cultura de 12 também.
- Incubar por 1 hora, agitando a cada 15 minutos para voltar a suspender as células uniformemente.
- Se uma monocamada confluente não foi alcançado após 1 hr, aspirar a suspensão celular e semeadura repetir com uma suspensão nova. Repita até que a densidade de célula desejada foi alcançada.
- Remova as peças complementares. Transferência de peças a fresco poços e incubar durante a noite para permitir que as células aderem e se espalhou completamente.
- Forma co-culturas, bloqueando partes apropriadas em qualquer lacuna ou configuração de contato. A configuração pode ser alterado em qualquer ponto desejado durante a cultura.
- Ao mudar de mídia, ter o cuidado de deixar pilhas secas para o tempo mínimo possível, de preferência apenas um segundo ou dois. Extrair fluido com uma mão e substituir imediatamente mídia usando a outra mão.
Peças de silício de processamento para reutilização:
- Faixa de células por imersão em água sanitária e enxaguar com água.
- Permitem que as peças secar completamente. Mergulhe em tolueno por 2 h para tira de poliestireno.
- Limpa em solução piranha (1:02 H 2 O 2: H 2 SO 4) aquecido a 120 ° C.
- Enxágüe por 15 minutos sob um fluxo contínuo de DDH 2 O. Se você não está indo para depósito de poliestireno imediatamente, guarde as peças em água.
- Dissolver poliestireno em tolueno a 100 mg / ml. Vortex em polipropileno cônica por cerca de 1 hora, ou até completamente dissolvido. Um pouco mais de 1 ml de solução é necessária para cada 10 partes.
- Spin-solução de poliestireno casaco peças de silício individuais em 2400 rpm por 30 seg.
- Leve ao forno por pelo menos 5 horas a 120 ° C.
- Tratar com plasma de oxigênio (200 mTorr, 200 W) durante 1 min.
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Discussion
Este sistema é o único que permite que a organização espacial do tecido a ser manipulada de forma dinâmica a nível celular. Conseqüentemente, este dispositivo permitiu uma série de novas experiências biológicas, abrangendo temas como a dinâmica de sinalização intercelular, entre em contato mediada contra sinalização solúveis, as decisões destino celular, toxicologia e crosstalk celular. Este dispositivo deve ser amplamente generalizável desde o substrato plástico a cultura é a cultura padrão do tecido, eo sistema é compatível com métodos de cultura padrão e ensaios. Por isso, acreditamos que esta plataforma será de grande interesse como uma ferramenta para o estudo de célula-interação entre diferentes células e tecidos.
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Acknowledgments
Os autores agradecem Salman Khetani, Jared Allen, Chris Flaim, e Austin Derfus para discussões úteis durante o processo de projetar esse dispositivo. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Faculdade Early Career Development Program, National Institutes of Health / National Institute of Diabetes e Doenças Digestivas e Renais, e David e Lucile Packard Foundation. EEH foi apoiado por uma Kirschstein Ruth L. Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Silicon Comb Substrates | Tool | N/A | N/A | Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu). |
References
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
Micromechanical control of cell-cell interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17389399&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum 5722-5726 (2007). - Bhatia, S. N., Balis, U. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells. The FASEB Journal. 13, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10544172&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum 1883-1900 (1999).
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