Summary
Un protocolo general para el estudio de la invasión de las células huésped por un patógeno bacteriano, centrándose en
Abstract
Aquí vamos a describir la forma en que el estudio de la invasión de las células endoteliales humanas por Staphylococcus aureus patógeno bacteriano. El protocolo general se puede aplicar al estudio de la invasión de las células de prácticamente cualquier bacteria cultivables. Las etapas en las que los aspectos específicos de la invasión se puede estudiar, como por ejemplo el papel de la reorganización de actina o caveolas, se destacó. Las células hospedadoras se cultivan en frascos y cuando esté listo para su uso se siembran en placas de 24 pocillos que contienen cubreobjetos Thermanox. Utilizando cubreobjetos permite su posterior eliminación de las células de los pozos para reducir la interferencia de las proteínas del suero deposita en las paredes de los pozos (a la que se conceden por S. aureus). Las bacterias se cultivan a la densidad requerida y se lavan para eliminar cualquier proteínas secretadas (por ejemplo, toxinas). Cubreobjetos con capas confluentes de células endoteliales son transferidos a nuevas placas de 24 pocillos que contienen medio de cultivo fresco antes de la adición de bacterias. Las bacterias y las células se incuban juntos por la cantidad de tiempo requerido en el 5% de CO 2 a 37 ° C. Para S. aureus suele ser entre 15-90 minutos. Cubreobjetos Thermanox se eliminan de cada pozo y la inmersión se lavan en PBS para eliminar las bacterias sin ataduras. Si el total de bacterias asociadas (adherente e internalizado) se cuantifica, cubreobjetos se colocan en un lugar bien fresco que contiene 0,5% de Triton X-100 en PBS. Pipeteo suave lleva a completar la lisis celular y las bacterias son enumerados por la dilución de serie y placas en agar. Si el número de bacterias que han invadido las células que se necesita, cubreobjetos se añaden a los pocillos con 500 l medio de cultivo de tejidos suplementado con gentamicina y la continuación de incubación de 1 h, lo que va a matar todas las bacterias externas. Cubreobjetos puede ser lavado, las células lisadas y las bacterias enumeradas en placas en agar como se describió anteriormente. Si el experimento requiere la visualización directa, cubreobjetos se fijaron y se tiñeron para microscopía óptica, fluorescencia o confocal o preparados para microscopía electrónica.
Protocol
El protocolo siguiente se describe el estudio de la invasión de las células endoteliales por S. aureus, pero en teoría puede ser utilizada para estudiar la invasión celular por cualquier bacteria cultivables. Etapas específicas de S. Las células endoteliales aureus y se indican.
1. Preparación de las bacterias
- Cultura S. por cepas de Staphylococcus 04.16 h (en función de la fase de crecimiento es necesario) en 10 ml de infusión cerebro-corazón (BHI) caldo de cultivo a 37 ° C en el aire con agitación a 200 rpm. Estas condiciones de crecimiento son específicos para S. aureus y pueden necesitar ser adaptado para otras bacterias.
- Lávese las bacterias en tres ocasiones en la Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Invitrogen) por rondas alternas de centrifugación a temperatura ambiente (5.000 x g, 10 min), la eliminación del sobrenadante del cultivo y la resuspensión del sedimento bacteriano en un volumen equivalente de DMEM. Medir la densidad óptica de la suspensión resultante de bacterias que se pueden ajustar según sea necesario. Para S. aureus, preparamos una suspensión a OD 600 = 1, que corresponde a ~ 10 9 ufc ml -1.
2. Cultivo de células endoteliales
- La cultura de la línea de células endoteliales EA.hy926 1 en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS; 10%) y L-glutamina (2 mM) a 37 ° C en CO2 al 5%. Por otra parte, se agruparon las células humanas primarias endoteliales de vena umbilical (HUVEC) se pueden adquirir de Lonza (Basilea, Suiza) y se cultivaron en un medio endotelial basal suplementado con FBS al 2%, extracto de cerebro bovino (incluida la heparina), el factor humano de crecimiento del endotelio y la hidrocortisona a 37 ° C en 5% de CO 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lonza). Estas condiciones de crecimiento son específicos para estas células y pueden necesitar ser adaptados para otros tipos de la célula huésped.
- Se cultivan las células endoteliales en frascos T75 para completar la confluencia, verificado por los ojos.
- Preparar las placas de 24 pozos para la inserción de los cubreobjetos. Pinzas finas (llama esterilización) se necesitan para mover el cubreobjetos, que tienen una superficie brillante y opaco uno. Cubreobjetos a cabo en los pozos de la placa de 24 pocillos con la superficie opaca hacia arriba para permitir la adhesión celular.
- Liberar a las células del frasco T75 con 3 ml de tripsina-EDTA (0,25%) y añadir 10 ml del medio de cultivo correspondiente.
- Añadir 500 l de células se resuspendió en 24 y placas que contienen cubreobjetos Thermanox vidrio. Un frasco T75 confluentes de células proporcionan suficientes células por dos placas de 24 pozos, lo que resulta en aproximadamente 5 × 10 5 células por pozo (en 500 l medio).
- Incubar las placas durante 48 horas como se describe anteriormente, y verificar 100% de confluencia de células al microscopio de luz invertida.
- Dip de lavado cubreobjetos en PBS y añadir nuevas placas de 24 pocillos que contiene 490 l MEDM con 10% de SFB en cada pozo.
- Para examinar el papel de determinados procesos metabólicos en la invasión celular, los inhibidores se pueden añadir a las células cultivadas 1 h antes de la adición de las bacterias y las concentraciones de mantener durante el ensayo. Por ejemplo, para determinar el papel de la reorganización de la actina en S. aureus invasión de las células endoteliales, 50 M citocalasina D se pueden añadir, o para el papel de caveolas, 5 mM metil-β-ciclodextrina se puede añadir.
3. La invasión de ensayo
- Añadir 10 l de bacterias lavado (aproximadamente, 2 x 10 7 ufc ml -1 S. aureus) a cada pocillo con un cubreobjetos se lavaron con una capa confluente de células endoteliales en 490 l DMEM con 10% de SFB.
- Incubar durante 15-90 minutos a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Para medir el número total de bacterias asociadas con las células (adherente e internalizado), baño de lavado de los cubreobjetos tres veces en PBS y se añade a los pozos nuevos con 500 l 0,5% de Triton X-100 en PBS. Para asegurarse de que las células totalmente lisis y la liberación de todas las bacterias internalizadas, pipeta varias veces, señalando que la punta de la pipeta directamente en la superficie del cubreobjetos.
- Enumerar las bacterias en placas de la suspensión líquida (o diluciones de esta en caso necesario) sobre la superficie de las placas de TSA. Desde TX-100 se lisar muchas bacterias Gram-negativas, la saponina se puede utilizar en lugar de dos.
- Para medir el número de bacterias internalizadas, separar el sobrenadante de cultivo de cada bacteria no consolidados y que contiene y reemplazar con 500 l de FBS DMEM/10% suplementado con 200 mg ml -1 gentamicina. Nosotros usamos la gentamicina en lugar de lysostaphin aquí, ya que es más barato y nos permite cambiar entre los experimentos con diferentes tipos de bacterias (por ejemplo, los estafilococos y Lactococci) sin tener que cambiar el protocolo experimental.
- Incubar las placas a 37 ° C en 5% CO 2 durante 60 minutos para matar todas las bacterias extracelulares.
- Lave cubreobjetos 3 veces en PBS,lisis y enumerar en placas TSA a la descrita para el ensayo de adhesión anteriormente.
- En algunos casos puede ser preferible contar visualmente el número de bacterias mediante microscopía de luz. En este caso, y específico para S. aureus invasión celular, el uso lysostaphin (10 mg ml -1) en lugar de gentamicina para destruir físicamente las bacterias extracelulares.
- Incubar cubreobjetos de 20 minutos a 37 ° C en CO 2 en la solución de lysostaphin, luego enjuague y fijar con Cytopath (Cellpath).
- Inundar el cubreobjetos con cristal violeta (0,5% w / v) durante 5 minutos.
- Dip-enjuague con agua, aire seco y montaje en portaobjetos de vidrio. El número de bacterias por mm 2 de las células endoteliales confluentes se puede cuantificar mediante microscopía de luz.
4. Los resultados representativos:
Expresión de proteínas de unión a la fibronectina (FnBPA y FnBPB) en la superficie de S. aureus confiere la capacidad de invadir las células endoteliales. Un trabajo reciente ha redefinido el dominio de unión a fibronectina de FnBPA 3. De tipo salvaje (WT) S. aureus 8.325,4 invade las células endoteliales con una alta eficiencia, mientras que una cepa que carecen de ambos FnBPA y B (Δ FNB) mostraron niveles significativamente reducidos de internalización (Figura 1). Complementación del mutante con un plásmido que codifica una FNB menos el dominio de unión a fibronectina (pFnR0) no promover la invasión (Figura 1). Por el contrario, la complementación de los mutantes con un plásmido que codifica la FNB todo un gen (pFnBA4) restauró la invasión de los niveles de WT (Figura 1).
El papel de FnBPA en la invasión de las células endoteliales también se puede demostrar utilizando la expresión heteróloga Lactococcus lactis anfitrión. Expresión de plásmidos codifican FnBPA en L. lactis (pRM9 9) no mejoran significativamente la adhesión a células endoteliales en comparación con las bacterias que expresan no FnBPA (CTL) (bares abiertos, Figura 1B). Por el contrario, FnBPA expresan L. lactis invadido las células endoteliales a niveles significativamente más altos que la cepa no expresa (bares cerrados, Figura 1B).
Los experimentos se llevaron a cabo cuatro veces por duplicado y la media ± desviación estándar se presenta. * Representan los datos que son estadísticamente significativa (p = <0,05) de los valores de WT o CTL.
Figura 1. La invasión de EA. Hy926 las células endoteliales de S. aureus (A) o L. lactis (B).
Discussion
El ensayo se describe se basa en el ensayo de protección de la gentamicina, que se ha utilizado ampliamente para estudiar la invasión de las células huésped por las bacterias. Las observaciones de la incapacidad de los antibióticos gentamicina y otros para matar las bacterias intracelulares se utilizaron en los primeros estudios sobre la invasión de las células huésped por 4-8 bacterias. El uso de 24, 48 o incluso 96 y placas permite la generación de grandes cantidades de datos cuantitativos y reproducibles en un corto período de tiempo ya un costo relativamente bajo. El ensayo también es atractivo porque no requiere de equipos especializados, que pueden ser adaptados para trabajar con varias bacterias y células, y puede ser utilizado para estudiar el papel de los procesos celulares bacterianas y de acogida en la invasión 9. De hecho, desde los primeros experimentos, el ensayo de protección de la gentamicina se ha empleado ampliamente para medir la invasión de la célula huésped por una serie de diferentes bacterias o incluso combinaciones de bacterias 10,11. Si bien los principios básicos son las mismas variaciones, muchas sutiles en el método se han reportado. En este artículo hemos descrito nuestra versión e indicó que las modificaciones que sean necesarias para otras bacterias o las células huésped. Al diseñar un experimento para medir la invasión de la célula huésped utilizando este enfoque, hay una serie de puntos importantes a considerar:
Sensibilidad bacteriana a la gentamicina. Esto puede parecer obvio, pero es importante asegurarse de que la bacteria se está estudiando es susceptible a la gentamicina a la concentración, la temperatura y el tiempo de duración que se utilizará. En el caso de falta de sensibilidad, puede ser posible usar otros antibióticos 5. Un enfoque alternativo puede ser el uso de enzimas líticas (lysostaphin, mutanolisina, lisozima) 12.
La incubación y el inóculo. Al realizar esta prueba por primera vez es importante para establecer los tiempos de incubación óptimo y inóculo bacteriano que se utilizará. Por lo tanto, los experimentos iniciales debe examinar tanto la adherencia y la invasión a través del tiempo (5 min a un máximo de 6 h). También es importante para evaluar la invasión se ve afectada por la multiplicidad de infección (MOI, el número de bacterias por célula). En general, lo mejor es utilizar el menor número de bacterias es posible ya que esto reducirá el daño a las células cultivadas. Importantes diferencias entre las cepas se puede perder si durante largos períodos de incubación o inóculos grandes se utilizan 9,13.
El daño celular. Es importante lavarse las bacterias antes de su uso. Sin embargo, el daño celular no se limita a la producción de toxinas. La invasión bacteriana, la inducción de la apoptosis y la alteración de las funciones celulares pueden causar daño celular. Esto puede llevar a la penetración de la gentamicina en la célula, matando a las bacterias internalizadas y dando la impresión de que la invasión no se ha producido 14.
Las condiciones de incubación. La temperatura y la composición del medio de cultivo puede tener un impacto significativo en la invasión. Por ejemplo, la invasión de las células HeLa por Streptococcus pyogenes depende de la presencia de fibronectina soluble, la cual está normalmente presente en el suero 15. Otra consideración es el crecimiento de bacterias en el medio de cultivo durante el transcurso del experimento.
Cultura y cuantificación de bacterias intracelulares. A pesar de TX-100 no puede matar a las bacterias intracelulares, que pueden inhibir su crecimiento. Como tal, es importante comprobar la replicación bacteriana en el medio sólido en presencia del detergente. Cuando existan, puede ser posible utilizar concentraciones más bajas del detergente o usar una alternativa como la saponina. Una de las ventajas de la protección de ensayo gentamicina sobre el cristal violeta y el ensayo de microscopía es que es menos mano de obra, y permite la detección y diferenciación de las sub-poblaciones de bacterias internalizadas. Por ejemplo, S. aureus puede producir un tipo de colonia normal (NCT), o la variante pequeña colonia (SCV) 16, que no se distinguiría por microscopía de las células bacterianas individuales. Una de las ventajas de la tinción de cristal violeta y el ensayo de microscopía en el ensayo de protección de la gentamicina es aglutinación de células pueden ser tenidos en cuenta y que las bacterias intracelulares que introducir una "viables pero no cultivables" voluntad estatal se detectaron 17.
Examinar el papel de los procesos de la célula huésped en la invasión bacteriana. Muchos estudios han utilizado inhibidores de la función de la célula huésped, como la citocalasina D, que interfiere con la reorganización de actina. Estos estudios también pueden incluir anticuerpos que se dirigen a los receptores de la superficie celular y caída siRNA de genes específicos 18. Es de vital importancia para garantizar que estos tratamientos no afectan a la viabilidad o la unión de las células cultivadas o tener efectos tóxicos sobre las bacterias.
Orientación futura:
CONTENIDO "> Debido a que este ensayo se realiza típicamente en múltiples placas de cultivo celular, es teóricamente posible adaptarlo a una operación de selección de alto rendimiento, lo que podría implicar el examen de las bibliotecas de los posibles inhibidores de la función celular, antiinfecciosos o antibióticos diseñados para atacar las bacterias intracelulares. Por otra parte, este enfoque podría utilizarse para detectar bibliotecas mutantes para identificar genes implicados en la adhesión, la invasión o la supervivencia intracelular. En algunos casos puede ser deseable incluir las fuerzas de corte (de flujo) en el sistema modelo, por ejemplo, cuando se modela el endotelio, para imitar más de cerca el ambiente en vivo. Los avances actuales en el diseño y la fabricación de celdas de flujo y sistemas de cultivo celular de microfluidos ofrecer la posibilidad de emplear el ensayo de protección de la gentamicina en huésped-patógeno modelos que incorporan las fuerzas de cizalla.En resumen, el protocolo descrito aquí se basa en métodos similares usados durante muchos años. Que es ampliamente aplicable a muchos tipos de células cultivadas y especies de bacterias y puede generar grandes cantidades de datos de forma rápida ya un costo relativamente bajo.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (WT 0.795.880).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
