Семь шагов к звездчатых клеток
Summary
Здесь мы опишем метод изоляции печени звездчатые клетки печени мышей. Для очистки звездчатые клетки, печень мыши перевариваются<em> На месте</em> И<em> В пробирке</em> По проназы-коллагеназы лечения до центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод дает очень чистый звездчатых клеток печени.
Abstract
Звездчатых клеток печени являются печень-нерезидентов клетки звездчатых морфологии и расположены в пространстве между Диссе печени синусоидальных эндотелиальных клеток и гепатоцитов 1,2. Stellate клетки, полученные из костного мозга предшественников и хранить до 80% от общего витамина тела 1, 2. После активации звездчатых клеток дифференцироваться в миофибробластов производить внеклеточного матрикса, тем самым способствуя фиброза печени 3. Основываясь на их способность к сокращению, myofibroblastic клетки звездчатые может регулировать сосудистый тонус связанные с портальной гипертензией 4. В последнее время мы показали, что клетки печеночной звездчатые являются мощными антиген представляющих клеток и могут активировать NKT клетки, а также обычные Т-лимфоциты 5.
Здесь мы представляем метод для эффективной подготовки печеночных звездчатых клеток печени от мыши. Из-за их perisinusoidal локализации, изоляции звездчатых клеток печени является многоступенчатым процессом. Для того чтобы сделать звездчатых клеток доступны для изоляции от пространства Диссе, мышь печени являются перфузии на месте с пищеварительными ферментами проназы Е и коллагеназы П. После перфузии ткани печени подвергается дополнительной ферментной обработки с проназы Е и Р в Коллагеназа пробирке. Впоследствии метод использует огромное количество витамина А хранения липидных капель в клетках печеночных звездчатых. Эта функция позволяет разделение звездчатых клеток от других видов печеночных клеток путем центрифугирования на 8% градиент Nycodenz. Протокол, описанный здесь дает очень чистое и однородное население звездчатых клеток. Чистоту препаратов можно оценить с помощью окрашивания маркера молекулы глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), до анализа флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Кроме того, световой микроскопии показывает уникальный внешний вид звездообразных печеночных звездчатых клеток, которые укрывают большое количество липидных капель.
Взятые вместе, мы представляем подробный протокол для эффективной изоляции печеночных звездчатых клеток, в том числе представитель изображения их внешний вид и морфологические GFAP выражения, которые помогают определить сущность звездчатые клетки.
Protocol
Discussion
Звездчатых клеток печени регулируют существенные физиологические и патофизиологические процессы в печени. Более того, звездчатые клетки обладают антигенпрезентирующие свойства, что делает их важной составляющей печеночной иммунного ответа. Хотя звездчатых клеток печени составляе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась премии Смита семьи за выдающиеся достижения в области биомедицинских исследований и NIH RO1 AI083426-01 (FW). Патрик Maschmeyer и Мелани Flach поддерживаются стипендии кандидат от Boehringer Ingelheim Foundation.
Materials
| Name Of Reagent | Company | Catalog No. |
|---|---|---|
| 70μm Cell Strainer | BD | 352350 |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 |
| DMEM | Gibco | 11960 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv |
| EGTA | Fluka | 3777 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 |
| HEPES | Gibco | 15630 |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | HV-7523-70 |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 |
| Silicone Tube | Masterflex | HV-96440-14 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD | 353108 |
| Winged Infusion Set | Terumo | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. i. s. t. o. r. y. heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &. a. m. p. ;. a. m. p., Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e. Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
