Sette passi per Stellate Cellule
Summary
Qui si descrive un metodo per l'isolamento delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Per la purificazione delle cellule stellate, fegati mouse sono digeriti<em> In situ</em> E<em> In vitro</em> Da pronasi-collagenasi trattamento prima centrifugazione a gradiente di densità. Questa tecnica produce elevata purezza cellule stellate epatiche.
Abstract
Cellule stellate epatiche sono fegato residenti cellule simili a stelle morfologia e si trovano nello spazio di Disse tra fegato e cellule endoteliali sinusoidali 1,2 epatociti. Cellule stellate sono derivati dai precursori del midollo osseo e memorizzare fino a 80% del totale del corpo di vitamina A 1, 2. Dopo l'attivazione, le cellule stellate differenziarsi in miofibroblasti per produrre la matrice extracellulare, contribuendo così alla fibrosi epatica 3. Sulla base delle loro capacità di contrarsi, le cellule stellate myofibroblastic in grado di regolare il tono vascolare associata a ipertensione portale 4. Recentemente, abbiamo dimostrato che le cellule stellate epatiche sono cellule che presentano l'antigene potenti e possono attivare le cellule NKT così come convenzionali linfociti T 5.
Qui vi presentiamo un metodo efficiente per la preparazione delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Grazie alla loro localizzazione perisinusoidal, l'isolamento delle cellule stellate epatiche è un processo multi-step. Al fine di rendere accessibile a cellule stellate isolamento dallo spazio di Disse, fegati mouse sono perfusi in situ con l'pronasi E enzimi digestivi e Collagenasi perfusione P. In seguito, il tessuto epatico viene sottoposto ad ulteriore trattamento enzimatico con pronasi Collagenasi E e P vitro. Successivamente, il metodo sfrutta la massiccia quantità di vitamina A-la memorizzazione gocce lipidiche nelle cellule stellate epatiche. Questa funzione consente la separazione delle cellule stellate da altri tipi di cellule epatiche per centrifugazione su una pendenza dell'8% Nycodenz. Il protocollo qui descritto produce una popolazione altamente pura e omogenea delle cellule stellate. Purezza delle preparazioni può essere valutata dalla colorazione per il marcatore molecola di proteina gliale fibrillare acida (GFAP), prima dell'analisi al microscopio a fluorescenza e citometria a flusso. Inoltre, microscopia luce rivela l'apparizione unica di cellule epatiche stellate a forma di stella che ospitano grandi quantità di goccioline lipidiche.
Nel loro insieme, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento efficiente delle cellule stellate epatiche, comprese le immagini rappresentative del loro aspetto morfologico e di espressione GFAP che contribuiscono a definire l'entità delle cellule stellate.
Protocol
Discussion
Cellule stellate epatiche regolano essenziali processi fisiologici e fisiopatologici nel fegato. Inoltre, le cellule stellate possiedono proprietà presentanti l'antigene, rendendoli una componente importante della risposta immunitaria epatica. Sebbene le cellule stellate epatiche costituiscono il 10-15% del numero totale di cellule nel fegato, l'isolamento di queste cellule è impegnativo a causa della loro localizzazione nello spazio di Disse perisinusoidal.
Qui vi presentiamo un m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla famiglia Smith Award per l'eccellenza nella ricerca biomedica e NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer e Melanie Flach sono supportati da borse di dottorato da Boehringer Ingelheim Fondazione.
Materials
| Name Of Reagent | Company | Catalog No. |
|---|---|---|
| 70μm Cell Strainer | BD | 352350 |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 |
| DMEM | Gibco | 11960 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv |
| EGTA | Fluka | 3777 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 |
| HEPES | Gibco | 15630 |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | HV-7523-70 |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 |
| Silicone Tube | Masterflex | HV-96440-14 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD | 353108 |
| Winged Infusion Set | Terumo | 1SV27EL |
References
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