3D楕円体の生成のための簡単なハンギングドロップ細胞培養プロトコル
Summary
我々は、細胞 – 細胞相互作用の違いを定量化するために三次元組織のような回転楕円体とそれらの潜在的なアプリケーションを生成する単純な、急速な方法を説明します。
Abstract
細胞間の凝集と細胞 – 基質接着の研究は歴史的に硬質基材への付着性単層培養で行われている。組織内の細胞は、しかし、一般的に細胞は多くの近い隣人とし、細胞外マトリックス成分との親密な接続を確立した最密充填組織塊内に収められています。したがって、化学的環境と3次元組織内の細胞が経験する物理的な力は、単層培養で増殖させた細胞で経験したものよりも根本的に異なっています。これは、著しく細胞形態及びシグナル伝達に影響を与えることが示されている。いくつかのメソッドは、コラーゲンゲル1または生体材料足場2のセルのカプセル化を含む3次元細胞培養を生成するために考案されている。このような方法は、便利な一方、正常組織に見られる親密な直接細胞間接着のアーキテクチャを要約することはありません。単一の細胞が疎なECM製品の3次元網目構造内に分散されているのではなく、彼らがより密接に近似する培養システム。ここで、我々は、彼らは、細胞同士や細胞外マトリックス成分と直接接触している真の3D回転楕円体を形成するまで細胞がドロップ文化をハング内に配置し、生理的条件下でインキュベートされる、単純な方法を説明します。メソッドは特殊な装置を必要とせず、細胞間または細胞- ECM相互作用への影響を解明することに関心があると思われる非常に少量の任意の生物学的因子の付加を含むように適合させることができます。メソッドは、セル間の空間関係を指定するには、細胞間や細胞 – ECM間の相互作用の役割を解明するために共培養つ（以上）の異なる細胞集団にも使用できます。細胞間の凝集と細胞- ECMの接着は胚発生の研究の基礎、悪性浸潤における腫瘍間質細胞の相互作用、創傷治癒、及び組織工学への応用のためです。この簡単な方法は、生体力学的特性の測定のためのまたは生理学的に関連するモデルの分子的および生化学的解析のための細胞凝集のような組織を生成する手段を提供します。
Protocol
Discussion
研究では、三次元コンテキスト（3D）での培養細胞が異なる細胞の形態とリジッド2次元（2D）文化系9と比較してシグナル伝達をもたらすことが示されている。例えば、線維芽細胞に移入コラーゲンゲルは、3Dでの線維芽細胞の形態は、2D 10,11で観察されたものとはかなり異なっていることを示しています。同様に、三次元培養では、乳腺上皮細胞の組織特異的分化を誘導する?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、技術支援のために博士は東軒家に感謝したいと思います。この記事に表示される画像の一部は、博士マルコムS.スタインバーグ、分子生物学科、プリンストン大学と共同でいました。著者はまた、彼らの寛大な支援のために国防前立腺癌研究プログラム（助成金のPC – 030482およびPC – 991552）とNCI / NIH（助成R01CA118755）の部門に感謝の意を表します。
Materials
- automatic cell counter (BioRad TC10)
- shaking water bath with CO2 gable cover Model 3540 (Lab-line)
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
- Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. Germ-layer surface tensions and "tissue affinities" in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements. Dev Biol. 192, 630-644 (1997).
- Schotz, E. M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP J. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Li, D. Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle. J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing. Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).
- Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).
- Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).
- Wang, F. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).
- Weaver, V. M. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).
- Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells. J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).
- Bissell, M. J. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43, 494-496 (2007).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).
