Vibratome на разделы для работы с улучшенными Сохранение Cytoarchitecture из млекопитающих орган Корти
Summary
Простая процедура vibratome срезов органа Корти, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии описана. Эта процедура позволяет для улучшения сохранения тонкой cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, и, следовательно, обеспечивает точную количественную оценку типов клеток.
Abstract
Млекопитающих кортиева органа высокоупорядоченных сотовой мозаику mechanosensory волосы и nonsensory поддерживающие клетки
(Обзор в 1,2). Визуализация этой клеточной мозаики часто требует, чтобы орган Корти является кросс-секционного. В частности, nonsensory столп и клетки Дейтерса, ядра которых расположены при основании в отношении волосковых клеток, не могут быть визуализированы без перекрестного секционирования кортиева органа. Тем не менее, тонкое cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, в том числе тонких цитоплазматических процессов столп и клетки Дейтерса, трудно сохранить обычными гистологическими процедуры, такие как парафин и крио-срезов, которые совместимы со стандартными методами иммуногистохимического окрашивания.
Здесь я опишу простой и надежной процедуру, состоящую из vibratome секционирования улитки, иммуногистохимического окрашивания vibratome секций в целом гору, а затем с помощью конфокальной микроскопии. Эта процедура широко используется для immunhistochemical анализ многих органов, включая почки мыши конечностей, данио кишечника, печени, поджелудочной железы и сердца (см. 3-6 для отдельных примерах). Кроме того, эта процедура была успешен как для обработки изображений и quantitificaton столба номер ячейки в мутанта и контроля органов Корти в обоих эмбрионов и взрослых мышей 7. Этот метод, однако, в настоящее время широко не используется, чтобы исследовать млекопитающих орган Корти. Потенциал для этой процедуры как обеспечить повышенную сохранность тонкой cytoarchitecture из взрослых орган Корти и позволяют количественно оценить различные типы клеток описано.
Protocol
Discussion
Процедура vibratome секционирования, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии позволяет визуализацию органа Корти с минимальным повреждением тканей. Очевидно, конфокальной снимки, сделанные из внутренних районов в vibratome разделе показывают отличные сохранение клеточной морфо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотел бы отметить использование детских исследований Института Основные изображений для конфокальной микроскопии и доктор Чжан Цзянь за предложение монтировать разделы, используя агарозном бисером. Эта работа финансировалась NIH грант DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
