Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón
Summary
Este monte se<em> In situ</em> Protocolo de hibridación se analizan los pasos críticos que garantizan resultados reproducibles de alta calidad para estudios de expresión génica en E8.5-E11.5 embriones de ratón días de edad.
Abstract
Todo el montaje hibridación in situ es un enfoque muy informativo para la definición de patrones de expresión genética en los embriones. La hibridación in situ en los procedimientos son largos y técnicamente exigente con varios pasos importantes que en conjunto contribuyen a la calidad del resultado final. Este protocolo describe en detalle varios pasos clave de control de calidad para el etiquetado de la optimización de la sonda y el rendimiento. En general, el protocolo ofrece una descripción detallada de las medidas necesarias fundamental para obtener resultados de alta calidad reproducible. En primer lugar, se describe la generación de digoxigenina (DIG) marcado con sondas de ARN mediante transcripción in vitro de las plantillas de ADN generados por PCR. Se describen tres ensayos críticos de control de calidad para determinar la cantidad, la integridad y la actividad específica de la etiqueta DIG-sondas. Estos pasos son importantes para la generación de una sonda de la sensibilidad suficiente para detectar ARNm endógeno en un embrión de ratón entero. Además, se describen los métodos para la fijación y almacenamiento de E8.5-E11.5 embriones de ratón días de edad para la hibridación in situ. A continuación, se describen los métodos detallados para la digestión de proteinasa K limitado de los embriones rehidratado seguido de los detalles de las condiciones de hibridación, lavados post-hibridación y el tratamiento de RNasa para eliminar inespecíficos hibridación de la sonda. Un anticuerpo AP-conjugado se utiliza para visualizar la sonda marcada y revelar el patrón de expresión de la transcripción endógena. Los resultados representativos se muestran a partir de experiencias exitosas y las típicas experiencias óptimas.
Protocol
Discussion
Los métodos descritos en este protocolo ha sido adaptado de una serie de fuentes diferentes y optimizado para montaje en toda E8.5-E11.5 embriones día de vida del ratón. Los métodos para montar toda la hibridación in situ de embriones de los vertebrados aparecieron por primera vez a principios de 1990 2,5-12. Este protocolo fue adaptado sobre todo de los métodos desarrollados para embriones de Xenopus 7,8 y 2,11 ratón. En nuestro protocolo de una gran cantidad de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R21MH082360 (BGC) y R01HD056315 (MNR), así como la Universidad de Georgia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
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