Всего горы<em> На месте</em> Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши
Summary
Вся эта гора<em> На месте</em> Гибридизации протокола обсуждаются важнейшие шаги, которые обеспечивают воспроизводимое высокое качество результатов для исследования экспрессии генов в E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши.
Abstract
Всего крепления в гибридизация является очень информативным подходом для определения моделей экспрессии генов в эмбрионах. На месте процедуры гибридизации длительным и технически сложных с несколькими важными шагами, которые в совокупности способствуют повышению качества конечного результата. Этот протокол подробно описывает несколько ключевых контроля качества шаги для оптимизации маркировки зонда и производительности. Целом, наш протокол содержит подробное описание критических шагов, необходимых для воспроизводимо получать высококачественные результаты. Во-первых, мы описываем поколения digoxygenin (DIG) меченых зондов РНК в пробирке с помощью транскрипции ДНК шаблонов генерируется с помощью ПЦР. Мы описываем три критические анализы контроля качества, чтобы определить количество, целостность и удельной активности DIG-меченых зондов. Эти шаги являются важными для создания зонда достаточной чувствительностью для обнаружения эндогенных мРНК в целом эмбриона мыши.Кроме того, мы опишем методы фиксации и хранения E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши в гибридизация. Затем мы описываем подробные описания методов для ограниченного протеиназы К переваривания регидратации эмбрионов следуют подробности условий гибридизации, пост-гибридизации моет и РНКазы обработку для удаления неспецифических зонда гибридизации. AP-конъюгированных антител используется для визуализации меченых зондов и выявить паттерн экспрессии эндогенного стенограммы. Представитель результаты показаны от успешных экспериментов и типичные оптимальным экспериментов.
Protocol
Discussion
Методы, описанные в этом протоколе были адаптированы из ряда различных источников и оптимизированы для целого крепления E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши. Методы целом крепления на месте гибридизации эмбрионов позвоночных впервые появился в начале 1990-х 2,5-12. Этот протокол был ад…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH R21MH082360 (BGC) и R01HD056315 (NRM), а также в Университете Джорджии.
Materials
| Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
- Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
- Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
- Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
- Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
- Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
- Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
- Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
- Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).
