Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade
Summary
We presenteren een methode voor het chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia weefsel na axonale schade. De aanpak kan worden gebruikt om specifieke transcriptiefactor bindingsplaatsen en epigenetische modificatie van histon en DNA belangrijk voor de regeneratie van axonen gewonden in zowel het perifere en het centrale zenuwstelsel te identificeren.
Abstract
Axonen in het centrale zenuwstelsel (CZS) niet regenereren, terwijl die in het perifere zenuwstelsel (PNS) doen regenereren in beperkte mate na een blessure (Teng et al., 2006).. Het is bekend dat transcriptionele programma's essentieel zijn voor neurieten en axonale uitgroei zijn opnieuw op schade in de PNS (Makwana et al., 2005).. Echter, de beschikbare instrumenten neuronale genregulatie in vivo te analyseren zijn beperkt en vaak uitdagend.
De achterwortelganglia (DRG) bieden een uitstekende blessure modelsysteem omdat zowel de centrale en perifere worden gestimuleerd door een gespleten axon afkomstig uit dezelfde soma. De ganglia vormen een discrete verzameling van cellichamen waar alle transcriptionele gebeurtenissen optreden, en dus zorgen voor een duidelijk omschreven gebied van transcriptionele activiteit die gemakkelijk en reproduceerbaar worden verwijderd van het dier. Letsel van zenuwvezels in de PNS (bijv. heupzenuw), waar de axonale regeneratie optreedt, moet onthullen een set van transcriptionele programma's die zich onderscheiden van degenen die reageren op een soortgelijke blessure in het CZS, waar de regeneratie vindt niet plaats (bijv. ruggenmerg ). Sites voor transcriptie factor binding, histon-en DNA-wijzigingen als gevolg van letsel aan een PNS of CZS kan worden gekarakteriseerd met behulp van chromatine immunoprecipitatie (chip).
We beschrijven hier een ChIP protocol met vaste muis DRG weefsel na axonale schade. Deze krachtige combinatie zorgt voor een middel voor het karakteriseren van de pro-regeneratie chromatine-omgeving nodig zijn voor het bevorderen van axonale regeneratie.
Protocol
Discussion
Dit protocol biedt een methode om direct over de chromatine-omgeving te vragen tijdens de axonale regeneratie in het volwassen zenuwstelsel na axonale schade. Het bevat de DRG letsel model met chromatine immunoprecipitatie te probe de transcriptie en epigenetische omgeving na letsel aan de PNS of CNS niet. Het is met name nuttig voor onderzoekers die graag vermoedelijke bindingsplaatsen voor hun favoriete transcriptiefactor karakteriseren, en te bepalen of de bezetting van deze sites gebeurt in reactie op de blessure. E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Andrea Tedeschi bedanken voor de hulp bij het bepalen van de aanvankelijke ChIP experimenten in het laboratorium en Ricco Lindner voor zijn bijdrage te fine-tunen van de voorwaarden voor Chip. Dit werk werd ondersteund door de Hertie Stichting; de Fortune Grant, de Universiteit van Tübingen, en de DFG DI 1497/1-1 subsidies (alle toegekend aan Simone Di Giovanni).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
