Mosaico de Análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación Cre
Summary
Un<em> In vivo</emMétodo> para poner a prueba la función del gen en el cerebro postnatal se describe. AAV recombinantes que expresan Cre y / o una proteína fluorescente se inyectan en el cerebro de ratones recién nacidos. Inactivación del gen de mosaico y el etiquetado neuronales dispersos se logra, permitiendo un análisis rápido de la función de genes en los procesos críticos para el desarrollo de circuitos neuronales.
Abstract
Función normal del cerebro se basa no sólo en el desarrollo embrionario, cuando las principales vías neuronales se establecen, sino también sobre el desarrollo postnatal cuando los circuitos neuronales son maduros y refinados. Regulación deficiente en esta etapa puede conducir a trastornos neurológicos y psiquiátricos como el autismo y la esquizofrenia 1,2. Muchos genes han sido estudiados en el cerebro prenatal y se encontró crucial para muchos procesos de desarrollo 3.5. Sin embargo, su función en el cerebro postnatal se desconoce, en parte debido a su eliminación en ratones conduce a menudo a mortalidad durante el desarrollo neonatal, y en parte porque sus requerimientos en el desarrollo temprano dificulta el análisis post-natal. Para superar estos obstáculos, los alelos floxed de estos genes se están generando en los 6 ratones. Cuando se combina con alelos transgénicos que expresan la recombinasa Cre en tipos celulares específicos, la supresión condicional se puede lograr para estudiar la función génica en el cerebro postnatal. Sin embargo, este método requiere alelos adicionales y el tiempo extra (3-6 meses) para generar los ratones con genotipos apropiados, lo que limita la expansión del análisis genético a gran escala en el cerebro del ratón.
Aquí se demuestra un enfoque complementario que utiliza de forma viral, expresa Cre para estudiar estos alelos floxed rápida y sistemáticamente en el desarrollo cerebral postnatal. Mediante la inyección de recombinante virus adeno-asociados (rAAVs) 7,8 codificación Cre en el cerebro neonatal, que son capaces de eliminar el gen de interés en las diferentes regiones del cerebro. Al controlar el título viral y coexpressing un marcador de la proteína fluorescente, que al mismo tiempo se puede lograr la inactivación de genes mosaico y etiquetado neuronal escaso. Este método evita la necesidad de muchos genes en el desarrollo temprano, y nos permite estudiar la función de las células autónomas en muchos procesos críticos en el desarrollo cerebral postnatal, incluyendo el crecimiento axonal y dendrítico, ramas, y los azulejos, así como la formación de sinapsis y refinamiento. Este método ha sido utilizado con éxito en nuestro propio laboratorio (resultados no publicados) y otros 8,9, y se puede ampliar a otros virus, como lentivirus 9, así como a la expresión de shRNA o dominante proteínas activas 10. Por otra parte, mediante la combinación de esta técnica con la electrofisiología, así como de reciente desarrollo de herramientas de imagen óptica 11, este método ofrece una nueva estrategia para estudiar cómo las vías genéticas influyen en el desarrollo de circuitos neuronales y la función en ratones y ratas.
Protocol
Discussion
El método de inyección neonatal viral que aquí se presenta ofrece una forma sencilla y rápida para generar mosaicos en vivo para el estudio del desarrollo del cerebro postnatal. El método tiene la ventaja de los alelos floxed que están actualmente disponibles, así como aquellos que se están realizando a través de los genes de alto rendimiento focalización del proyecto 6. En comparación con el uso de la expresión transgénica de la CRE, este método proporciona una forma rápida para proba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por una subvención del NIH RO1 (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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