Summary
이 연구는 휴대용 RRT - PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.
Abstract
야생 조류는 철새 flyways 따라 감시를하라는, H5N1 subtype의 고도 병원성 조류 독감 (HPAI)의 확산에 연루되었습니다. 조류 독감 바이러스에 대한 야생 조류 (AIV)의 샘플링은 종종 원격 지역에서 실시하지만, 결과는 종종 있기 때문에 분자 테스트 갖춘 실험실에 샘플을 수송하기 위해 필요 지연됩니다. 실시간 역방향 transcriptase 효소의 연쇄 반응 (RRT - PCR)은 AIV의 진단을위한 가장 정확하고 민감한 방법 중 하나를 제공하는 분자 기법입니다. RRT - PCR에 필요한 이전에 엄격한 실험실 프로토콜 이제 필드에 적응하고 있습니다. 서부 유럽 표준시 시약의 수준에서 감도로, 감기에 사슬을 요구하지 않습니다 (동결 건조된) 동결 건조 시약의 개발은 현장에게 실질적인 목표에 원격 테스트를 가져왔습니다.
여기 우리는 동결 건조된 시약을 고용 RRT - PCR 장치 (Ruggedized 고급 병원체 식별 장치 또는 신속한, 아이다호 기술, 솔트 레이크 시티, UT) (인플루엔자 대상 1 Taqman를 사용하여 야생 조류의 AIV의 신속한 진단을위한 방법을 제시, ASAY을 - ASY - 0109, 아이다호 기술). 시약은 단일 튜브 적절한 농도에서 테스트에 필요한 모든 구성 요소를 포함 : primers, 프로브, 효소, 버퍼 내부 긍정적인 컨트롤, 부적 절한 보관 또는 서부 유럽 표준시 시약의 처리와 관련된 오류를 제거합니다. 휴대용 단위는 매트릭스 유전자 후 2-3 시간 후에 산출 결과를 대상으로 인플루엔자에 대한 화면을 수행합니다. 유전자 subtyping은 H5와 H7 프라이머와 함께도 가능합니다되는 대상에게 적혈구응집소 유전자를 설정합니다.
시스템은 철새 쇼어 버드 종의 자리에 시연 등 야생 조류에서 수집 cloacal와 oropharyngeal 샘플에 사용, 북부 캘리포니아에서 캡처한 서부 샌드피퍼 (Calidrus mauri). 적합합니다 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 기술의 주요 장점은 원격 위치에 확산을 포함하는의 기회를 증가, 야생 조류의 진단을 신속하게하는 것입니다. 현장 진단은 또한 야생 인구에 감염된 개인을 식별하고 공부에 대한 유용합니다. 호스트 생물학 (감염 면역 및 생리 반응)과 공간적 생태 (감염된 조류의 철새 실적)에 대한 정보를 수집하는 기회는 야생 조류가 장거리 AIV에 대한 벡터 역할을 수있는 범위에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.
Protocol
1. 미스트 그물을 사용하여 야생 조류 캡처
- 쇼어 버드 캡처 들어, 마시, 해안, 또는 머드 플랫과 같은 적극적인 식량 약탈을 배워 현장에서 미스트 그물을 설정합니다.
- 슬라이드 트레멀 라인 극 주변 미스트 그물의 한쪽 끝을의 루프와 진흙으로 수직 막대기를 삽입합니다.
- NET을 당겨 미스트 네트의 다른 끝에 트레멀 루프를 통해 초 장대를 삽입하고 수직으로 트레멀 라인이 진행되었는지 만들기, 진흙에 장대를 삽입합니다.
- 새가가 캡처되면 네트워크에서 새를 추출하고 banding 역으로 돌아갑니다.
2. Cloacal 면봉 샘플링
- 즉시 캡처 후 cloacal 면봉를 수집
- 배설강을 찾아 주변 깃털을 다시 밀어 손가락을 사용하여
- 멸균 Dacron 또는 폴리에스터 - 스쳐 면봉 포장을 푸는 먼저 끝 줄기와 보라고 더욱 쉽게 살균 바이러스성 전송 매체와 팁을 축축하게하다. moistening 후, 면봉의 전체 머리를 부드럽게 하수구에 삽입됩니다. 천천히 면봉을 휘두르네 및 하수구에서 면봉을 제거하여 하수의 면봉은 내부 원주.
- 직접 바이러스 수송 미디어 샘플 약병에 면봉의 팁을 삽입, 면봉은 미디어에있는 동안 엄지와 집게손가락 사이에 면봉으로 샤프트를 회전. 면봉 팁은 유리병에 남아와 샤프트가 방해하지 않도록 조교는 가위로 ~ 1cm 유리병의 바닥에서 면봉을 다시의 팁을 당기는하여 절차를 완료하고 면봉의 샤프트를 차단 캡 폐쇄. 단단히 캡 유리병. 면봉 샤프트를 절단 사이에 알코올로 가위를 소독.
- 드라이 아이스이나 얼음 팩을 중 하나를 포함하는 냉동실 상자에 튜브를 삽입합니다.
3. Oropharyngeal 면봉 샘플링
- choanal 짧게 볼 수 있도록 부드럽게 새의 부리를 열고
- 패키지에서 깨끗한 면봉 포장을 푸는 먼저 끝 줄기와 보라고 더욱 쉽게 바이러스성 전송 매체와 팁을 축축하게하다
- 다른 표면에 끝을 건드리지 않고, 입 및 면봉으로 입안의 지붕에있는 choanal 오프닝에 삽입하고 oropharyngeal 또는 인후 지방쪽으로 계속
- 직접 바이러스성 전송 미디어 약병에 면봉의 끝을 놓으십시오. 면봉이 미디어에있는 동안 엄지와 집게손가락 사이에 면봉으로 축을 회전. 위와 같이, 지원자가 ~ 1cm 유리병의 바닥에서 면봉을 다시의 팁을 뽑아 면봉 팁은 유리병에 남아와 샤프트가 뚜껑에 방해가되지 않도록 가위로 면봉의 샤프트를 차단 폐쇄. 단단히 캡 유리병. 면봉 샤프트를 절단 사이에 알코올로 가위를 소독.
- 드라이 아이스 또는 얼음 팩이 들어있는 냉장고 상자에 튜브를 삽입합니다.
4. 버드 처리 및 릴리스
- 적시 (<20mins)에서 캡처 및 릴리스의 사이트에 새를 반환합니다. 처리기는 동물 복지의 원칙을 인식하고 샘플링하는 동안 고통 조류의 징후 (예 : 찰과상, myopathy 및 하이포 또는 고열을 캡처)에 대한 경고해야합니다. 기본적인 구급 상자가 장비 목록에 포함되어야합니다.
5. 시험 시설
- 샘플은 PCR 장치와 연결된 컴퓨터를 실행하는 전원 공급 장치 (전압 - 규제 발전기)와 같은 연구 트레일러 또는 십t 같은 밀폐된 공간에서 테스트할 수 있습니다.
6. RNA 추출
- RNA 추출은 스팩맨 외 다음과 같은 제조 업체의 지침을 약간 수정 RNeasy 미니 키트와 함께 수행했다. 1
- 소용돌이 면봉의 3-5 s에 대한 중간 및 2 ML의 microcentrifuge 관 350 μl를 전송. 참고 : PCR 양성 샘플 rescreened 또는 H5 테스트를 실행해야 할 필요 경우에 얼음에 남은 샘플 보관하십시오.
- 350 RLT 버퍼의 μl (β - 나와 함께) 5 S.위한 소용돌이 추가
- RNA 학년 70 % 에탄올 350 μl를 추가합니다.
- 5 분 5,000 XG에 원심 분리기.
- 2 ML 수집 관에 위치 스핀 컬럼에 뜨는 600 μl를 추가합니다. 테스트 튜브 랙의 나머지 샘플을 보유합니다.
- 흐름 -을 통해 10,000 XG 및 폐기 20 s에 대한 원심 분리기.
- 모든 샘플은 스핀 열의 통과 때까지 반복 17-18 단계를 반복합니다.
- 깨끗한 2 ML 수집 튜브의 스핀 열의를 놓습니다.
- 스핀 컬럼에 RW1 버퍼 700 μl를 추가하고 10,000 X G. 25 s를 원심 분리기 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- 10,000 X G. 25 S에 대한 스핀 컬럼 및 원심 분리기 500 μl RPE 버퍼를 추가합니다 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- RPE 버퍼 두 세척 총 22 단계를 반복합니다.
- 14,000 X G.시 추가 2 분 스핀 컬럼을 원심 분리기 수집 튜브를 폐기하십시오.
- 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 스핀 컬럼을 장소와 nuclease없는 물 50μl를 추가합니다. 60 S. 위해 상온에서 알을 품다
- 10,000 xgf 60 s에 대한 회전에 의해 Elute RNA또는 60 S. 이곳은 얼음에 샘플을 정화.
7. 부정적인 컨트롤을 준비
- 동결 건조된 시약은 TaqMan 프로브의 인플루엔자 대상 1 (ASAY - ASY - 0109)에 대한 아이다호 기술 프리즈 건조 시약 감지 키트의 지침에 따라 PCR 분석에 사용하기 위해 준비되었습니다.
- 알약은 하단에되도록 3 s에 대한 부정적인 제어 시약의 약병 (적색)을 원심 분리기.
- 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오.
- 2 X의 Reconstitution 버퍼 20 μl 시약 학년 워터 20 μl를 추가합니다.
- 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동.
- 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기.
- 시각 단계 31-32를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오.
- Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다.
8. 준비 테스트 샘플
- 알약은 하단에되도록 3 초에 대한 미지의 시약의 약병 (파란색)을 원심 분리기.
- 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오.
- 정화 RNA 40 μl를 추가합니다.
- 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동.
- 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기.
- 시각 단계 38-39를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오.
- Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다.
9. 긍정적인 컨트롤을 준비
- 알약은 하단에되도록 3 s에 대한 긍정적인 제어 시약의 약병 (녹색)을 원심 분리기.
- 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오.
- 2 X의 Reconstitution 버퍼 20 μl 시약 학년 워터 20 μl를 추가합니다.
- 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동.
- 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기.
- 시각 단계 45-46를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오.
- Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다.
10. 모세관 튜브를 Centrifuging
- 일단 배치를위한 모세관 튜브의 모든 모세관 어댑터가 장착되어 미니 원심 분리기로 그들을 로드할 준비가되었습니다.
- 1 S. 위해 아래 펄스 버튼을 누른 가장 낮은 설정에서 원심 분리기 이것은 테스트를 위해 준비에있는 바닥에 액체 전달합니다.
11. 빠른 작동
- 새 파일을 만듭니다. 분류 긍정적인 제어, 부정적인 제어 및 샘플 (자신의 ID 번호에 의해).
- 프로그램 1 : RNA 샘플 준비 잡아
- 사이클 = 1
- 분석 모드 = 없음
- 대상 온도 = 40
- 부화 시간 = 30 분
- 온도 전환 속도 = 20 ° C / 초 (기본값)
- 보조 온도 대상 = 0 (기본값)
- 스텝 크기 = 0 (기본값)
- 단계 지연 = 0 (기본값)
- 수집 모드 = 없음 (기본값)
- 프로그램 2 : RNA 변성
- 사이클 = 1
- 분석 모드 = 없음
- 대상 온도 = 94
- 부화 시간 = 120s
- 온도 전환 속도 = 20 ° C / 초 (기본값)
- 보조 온도 대상 = 0 (기본값)
- 스텝 크기 = 0 (기본값)
- 단계 지연 = 0 (기본값)
- 수집 모드 = 없음 (기본값)
- 프로그램 3 : RNA의 증폭
- 사이클 = 45
- 분석 모드 = 자동 분석
- 목표 온도, 세그먼트 1 = 94; 세그먼트 2 = 60
- 배양 시간, 세그먼트 1 = 0의, 세그먼트 2 = 20 S
- 1 & 2 독방 감금 온도 전환 속도 = 20 ° C / S (기본값)
- 보조 온도 대상, 독방 감금 1 & 2 = 0 (기본값)
- 단계 크기, 독방 감금 1 & 2 = 0 (기본값)
- 단계 지연, 독방 감금 1 & 2 = 0 (기본값)
- 취득 모드 = 없음 세그먼트 1; 세그먼트 2 = 싱글
- 형광 매개 변수
- 형광 채널 2 (Ch2 / 1) 모드를 표시합니다
이득 :- 채널 1 (F1) = 1
- 채널 2 (F2) = 8
- 채널 3 (F3) = 1
- 각 샘플에 대한 실시간 형광 데이터를 표시하려면, 관심의 샘플을 선택하고 화면의 하단에있는 '보기 그래프'버튼을 클릭
- 형광 채널 2 (Ch2 / 1) 모드를 표시합니다
- 각 모세관 경우, 결과는 다음과 같습니다 :
- # - 회전 목마의 회전 목마 위치를 식별
- 샘플 이름 - 샘플의 이름을 제공합니다
- 제어 - 각 샘플에 대한 샘플 유형을 indentifies
- 점수 - 샘플에서 샘플의 형광 배경 형광의 수준 사이의 관계를 사용하여 계산
- 결과 - 샘플에 대한 전체 결과를 표시합니다
12. 대표 결과 :
현재 : 시험 / 미지의 시료에 대한 빨간색 '현재'통화 대상 해당 샘플에서 확인 및 제어가 성공했음을 나타냅니다.감지되지 않음 : 테스트 / 알려지지 않은 샘플에 대한 녹색 '발견되지 않음'통화 대상 해당 샘플에서 발견하고 테스트 컨트롤이 성공 않았음을 나타냅니다.
반복하십시오 : '하시기 바랍니다 반복'는 긍정적이거나 부정적인 제어가 실패했음을 나타냅니다.
빠른 7,200에 의해 성공적인 분석의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 긍정적인 컨트롤은 증폭과 약 25 사이클 (X 축)에 감지 형광 (Y 축)을 생성합니다. 사이클 임계값 (CT)> 35 동의 컷 - 오프 가장 AIV 참조 실험실입니다. 따라서,이 방법에 대한 긍정적인 컨트롤 AIV 감지주기의 접수 번호 (0-35) 이내에 형광 신호를 생산. 반면, 부정적인 제어도 45 사이클 후 형광 신호를 생성하지 않습니다. 마찬가지로, 서쪽 샌드 파이 퍼스에서 수집한 열두 샘플 새들이 AIV에 대한 부정적인 것을 나타내는 형광 신호를 생성하지 않았다. 전통적인 실험실에있는 모든 긍정적인 샘플의 후속 테스트는 거짓 반응이 잘못 생성되지 않도록하는 것이 좋습니다입니다.
미스트 그물을 사용하여 그림 1. 쇼어 버드 캡처.
그림 2. 이상 샌드 파이 퍼스에서 cloacal와 oropharyngeal 샘플의 수집.
그림 3. RNA의 증폭에 대한 신속한 7200을 프로그래밍.
그림 4. 신속한 7200 휴대용 RRT - PCR은 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 성공적인 분석에 나타납니다 어떻게 표시에 의해 생성된 Fluorogram가. 전체 크기 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오
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Discussion
여기에 제시 빠른 진단 방법은 AIV의 감시에 대한 야생 조류 샘플 시간 효과적이고 정확하게 테스트를 용이하게합니다. 휴대용 RRT - PCR의 훨씬 덜 엄격한 표본 스토리지 요구 사항은 액체 질소 화주 또는 드라이 아이스를 사용할 수없는 경우 감기 체인의 유지 보수가 허무 수 있습니다 원격 상황에 적합합니다. 또한, 우리는 실험실 기반의 분자 분석의 최소한의 지식과 현장 생물학 자에 의해 수행되어야 정도로 간단했다 동결 건조 시약과 그 샘플 분석을 발견했습니다. 기술은 비용 효율적인 시간 효율 또한했습니다. 한 연산자, 그것은 현장 환경에서 매일 AIV에 대해 42 검사의 결과, 세 배치를 실행하는 가능했다. 우리는이 시스템을 실행하는 데 필요한 모든 자료가있는 위치와 방법은 하루의 과정을 통해 운영자에게 배운 수에 회부 수 있다고 평가. 원격 현장 상황에 제한 요인은 휴대용 RRT - PCR 장치와 연결된 컴퓨터를 실행하는 데 필요한 전원 공급 장치는하지만, 이것은 전압 - 규제 휴대용 전기 발전기의 사용을 통해 완화 수 있습니다. 또한, 추출된 RNA 또는 원본 샘플 시퀀싱하면 감기에 사슬이 일시적으로 실험실에 배달까지 유지 수있는 경우에만 가능합니다.
우리의 이전 분석 휴대용 RRT - PCR 장치가 동일한 특이성 (100 %) 및 실험실 setting2에서 수행한 바이러스 격리에 비해 감도 (98 %)를했다고 지적했다. 이전 유효성 연구는 거짓 제외 때문에 동결 건조된 시약 비드 1,3-4의 배설물 재료 또는 성능 저하에 PCR 억제제의 부적 절한 샘플 준비, 존재에 대한 큰 잠재력 RRT - PCR과 함께 가장 일반적인 오류는 것을 증명하고있다. 기술의 또 다른 단점은 AIV의 새로운 변종의 새로운보기에 동결 건조된 시약의 감도이다. 호스트가 중복 어디 바이러스 게놈 reshuffling의 지속적인 상태에서 다수의 phylogenetic 연구 5-8 지원 가설이다. 따라서 휴대용 RRT - PCR와 함께 사용하기위한 발급 primers와 프로브는 다시 검증 상수가 필요합니다. 예를 들어, H5와 H7 subtypes의 미국과 유라시아 lineages 특정 시약은 지금 biogeographic 지역 9에 따라 바이러스의 발산으로 인해 권장합니다. 다른 모든 필드 테스트와 마찬가지로 의심되는 HPAIV의 반응은 높은 특이성과 민감도 10 VI로 최종 확인 테스트 승인된 시설로 이송해야합니다.
결론적으로,이 연구는 휴대용 RRT - PCR이 아닌 실험실 설정에서 AIV에 대한 야생 조류에서 cloacal 샘플을 검사의 목적에 적합한 것을 보여주었다. 이 기술의 주요 장점은 빠른 응답 시간을 가진 원격 위치의 확산을 포함하는의 기회를 증가, 야생 조류의 진단을 신속하게하는 것입니다. 휴대용 RRT - PCR은 AIV의 확산에 야생 조류의 역할을 해명하려 연구자에 대한 돌파구를 나타냅니다. 샘플링 시에 호스트 상태를 진단하는 능력은 그것이 가능한 면역 및 생리 반응 감염 11, 12 야생 조류의 자연 저항과 관련된 유전자의 특성에 대한 핵심 질문을 해결하기 위해 생물 학적 정보를 수집합니다. 또한, 그들의 움직임을 추적 확인 호스트에 비용이 많이 드는 위성 송신기를 배포하는 것은 AIV의 장거리 통신 사업자뿐 아니라 가금류와의 철새 성능, 서식 환경 설정 및 상호 작용의 수준을 평가하는 역할을하는 수종 식별을위한 소중한 것입니다. 등 중앙 및 남아시아 13로 HPAIV 국제 관심 분야, 향후 운영 테스트는 결론 긍정적인 샘플의 다수의 진단 시간이 중요한 경우 빠른 RRT - PCR 장치가 확산 시나리오에 따라 수행하는 방법을 결정할 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원과 자금 조달 (S. Schwarzbach 호텔) 및 지원 (K. Spragens, T. 그레이엄)의 USGS 서부 생태 연구 센터 M. 비천한 사람과 아이다호 기술의 R. 크리 스프 감사하고 싶습니다. 국방부와 공군 연구소의학과 지원 국방 및 국토 안보부 (www.idhs.org) 연구소 - 본 연구는 혁신적인 기술을위한 센터의 후원하에 수행되었다. 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 간행물의 무역, 제품 또는 회사 이름의 사용은 설명용으로만 사용되며, 미국 정부에 의해 승인을 의미하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
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