High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi
Summary
Qui si descrive uno schermo plasmide sovraespressione in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Utilizzando una libreria schierate plasmide e un elevato throughput protocollo di trasformazione di lievito con un robot di manipolazione dei liquidi.
Abstract
Il lievito, Saccharomyces cerevisiae, è un sistema potente modello per la definizione di meccanismi fondamentali di molti importanti processi cellulari, tra cui quelle con rilevanza diretta per la malattia umana. A causa della sua breve tempo di generazione e ben caratterizzati genoma, uno dei principali vantaggi sperimentale del sistema modello lievito è la capacità di eseguire schermi genetico per identificare i geni e le vie che sono coinvolti in un dato processo. Nel corso degli ultimi 30 anni tale schermi genetici sono stati utilizzati per spiegare il ciclo cellulare, via secretoria, e molti altri aspetti altamente conservato della biologia delle cellule eucariotiche 1-5. Negli ultimi anni, diverse biblioteche genoma dei ceppi di lievito e plasmidi sono stati generati 6-10. Queste raccolte permettono ora per l'interrogatorio sistematico della funzione del gene utilizzando guadagno e la perdita di funzione approcci 11-16. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un high-throughput protocollo di lievito di trasformazione con un robot di gestione dei liquidi per eseguire uno schermo plasmide iperespressione, utilizzando una libreria di 5.500 schierati plasmidi lievito. Abbiamo utilizzato questi schermi per identificare i modificatori genetici di tossicità associata con l'accumulo di proteine umane di aggregazione a rischio di malattie neurodegenerative. I metodi presentati qui sono facilmente adattabili allo studio di altri fenotipi cellulari di interesse.
Protocol
Discussion
Qui vi presentiamo un protocollo per eseguire un elevato throughput schermo plasmide sovraespressione nel lievito. Questo approccio permette di screening rapido e imparziale per modificatori genetici di molti diversi fenotipi cellulari. Usando questo approccio, un ricercatore può schermo una porzione significativa del genoma del lievito in una questione di settimane. Questo approccio imparziale consente inoltre l'identificazione di modifica, che non possono essere previste in base ai risultati precedenti. Abbiamo u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro per la SLA Packard ricerca presso la Johns Hopkins (ADG), Premio New Innovator un direttore NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Rita Allen Foundation Scholar Award. ADP è uno studioso Pew nel Scienze Biomediche, sostenuto dal Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
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