Summary

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Published: June 09, 2011
doi:

Summary

We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.

Abstract

Muggen zenden een aantal verschillende virussen waaronder belangrijke menselijke ziekteverwekkers, zoals het West-Nijlvirus, knokkelkoorts virus, en chickungunya virus. Veel van deze virussen zijn toegenomen in hun endemische reeksen en uitgebreid met nieuwe gebieden, noodzakelijk effectief toezicht en controle programma's om te reageren op deze bedreigingen. Een strategie om te virusactiviteit monitoren omvat het verzamelen van grote aantallen muggen uit endemische sites en testen ze voor virale infectie. In dit artikel beschrijven we hoe te behandelen, verwerken, en het scherm het veld verzameld muggen voor besmettelijke virus door Vero celcultuur assay. Muggen zijn gesorteerd op locatie val en soorten, en gegroepeerd in zwembaden met ≤ 50 individuen. Gepoolde monsters zijn gehomogeniseerd in gebufferde zoutoplossing met behulp van een mixer-molen en de waterige fase wordt geënt op confluente Vero celculturen (Clone E6). Celculturen worden gecontroleerd op cytopathogeen ingang van dag 3-7 na de inoculatie en virussen gekweekt in celkweek worden geïdentificeerd door de juiste diagnostische testen. Door gebruik te maken van deze benadering hebben we geïsoleerde 9 verschillende virussen van muggen verzameld in Connecticut, VS, en onder deze, 5 is bekend dat de menselijke ziekte te veroorzaken. Drie van deze virussen (West-Nijl virus, Potosi virus, en La Crosse virus) vertegenwoordigen nieuwe records voor Noord-Amerika of het New England regio sinds 1999. De mogelijkheid om een ​​grote diversiteit aan virussen te detecteren is essentieel voor het toezicht op zowel gevestigde als opkomende virussen in de mug bevolking.

Protocol

1. Mosquito sorteren en identificatie De volgende procedures worden uitgevoerd op een open laboratorium bankje in een speciale bioveiligheidsniveau-2 (BSL-2) laboratorium door medewerkers die zijn opgeleid om te werken met live muggen. Een "koude keten" is gedurende de gehele procedure. Verdoven leven volwassen muggen door het plaatsen van mosquito collectie zak in een vriezer -20 ° gedurende 5 minuten. Overdracht opvangzak aan een geïsoleerde container met droog ijs. Sluit het deksel en…

Discussion

Vero celcultuur-test dient als een effectieve methode om het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit van virussen. Dit in tegenstelling tot moleculaire methoden die specifiek zijn gericht op een of een paar virussen van belang. Bovendien hebben we ontdekt dat Vero celcultuur-test ook is, zo niet gevoeliger dan RT-PCR 7 en biedt ons virusisolaten die in onze referentie collectie opgeslagen voor toekomstig onderzoek. Toch kan celkweek systemen niet geschikt zijn in veel gevallen. Deze aanpak maakt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij dankbaar erkennen de belangrijke bijdragen van Drs. John Anderson, Andrew Main en Shirley Tirrell aan deze studie. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) en het Amerikaanse ministerie van Landbouw (58-6615-1-218, CONH00768, en CONH00773).

Materials

Name of reagent/ equipment Company Catalog Number
Fetal bovine serum Gibco – Invitrogen 16140
Anti-biotic/mycotic Gibco – Invitrogen 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. Gibco – Invitrogen 25080
L-Glutamine 200mM 100x Gibco-Invitrogen 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) Gibco – Invitrogen 11700
10X Dulbecco’s PBS Gibco – Invitrogen 14080
Trypsin-EDTA Gibco – Invitrogen 15400
Rabbit serum Gibco – Invitrogen 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

References

  1. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).
  2. Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper’s hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
  3. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
  4. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
  5. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
  6. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
  7. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
  8. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
  9. Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).
  10. Karabatsos, N. . International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).
  11. Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
  12. Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).

Play Video

Cite This Article
Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

View Video