Summary

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Published: June 09, 2011
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Prozess-und Screen-Bereich gesammelt Mücken für eine Vielzahl von Viren durch Vero-Zellkultur-Assay. Durch den Einsatz dieser Technik haben wir 9 verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien erkannt in Mücken in Connecticut gesammelt.

Abstract

Mücken übertragen eine Reihe von unterschiedlichen Viren, einschließlich wichtiger menschlicher Krankheitserreger wie West-Nil-Virus, Dengue-Virus, und chickungunya Virus. Viele dieser Viren haben in ihrer endemischen Bereichen intensiviert und ausgebaut, um neue Gebiete, erfordern eine effiziente Überwachung und Steuerung Programme, um diese Bedrohungen zu reagieren. Eine Strategie zur Virus-Aktivität zu überwachen ist das Sammeln von einer großen Anzahl von Moskitos aus endemischen Standorte und testen sie für die virale Infektion. In diesem Artikel beschreiben wir, wie in der Handhabung, Verarbeitung und Display Mücken auf infektiöses Virus von Vero-Zellkultur-Assay-Feld-gesammelt. Mücken werden durch trap Lage und Arten sortiert, gruppiert und in Pools mit ≤ 50 Personen. Pooled Proben werden in Kochsalzlösung mit einem Mixer-Mühle und die wässrige Phase auf konfluente Vero-Zellkulturen (Clone E6) inokuliert homogenisiert. Die Zellkulturen werden für zytopathischen Wirkung vom Tage 3-7 post-Impfung und keine Viren in der Zellkultur gezüchtet durch die entsprechenden diagnostischen Tests identifiziert werden überwacht. Durch die Verwendung dieses Ansatzes haben wir 9 verschiedene Viren aus Moskitos in Connecticut, USA gesammelt isoliert, und unter diesen, 5 ist bekannt, dass Menschen eine Krankheit verursachen. Drei von diesen Viren (West-Nil-Virus, Potosi Virus und La Crosse-Virus) stellen neue Rekorde für Nordamerika oder der New England Region seit 1999. Die Fähigkeit, eine breite Vielfalt von Viren zu erkennen ist entscheidend für die Überwachung sowohl etablierte als auch neu auftretende Viren in der Mücke Bevölkerung.

Protocol

1. Mosquito Sortierung und Identifikation Die folgenden Verfahren basieren auf einer offenen Labortisch in einem dedizierten Biosicherheitsstufe-2 (BSL-2) im Labor von Mitarbeitern, die geschult, damit zu leben Mücken Arbeit durchgeführt werden. A "Kühlkette" ist während des gesamten Verfahrens beibehalten. Anesthetize leben Stechmücken, indem Mücke Auffangbeutel in einem -20 ° Gefrierschrank für 5 Minuten. Transfer-Auffangbeutel mit einem isolierten Behälter mit Trockeneis. Schli…

Discussion

Vero-Zellkultur-Assay dient als eine effektive Methode zur Dynprofeld-Mücken gesammelt für eine Vielzahl von Viren. Dies steht im Gegensatz zu molekularen Methoden, die gezielt eine oder einige wenige Viren von Interesse. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Vero-Zellkultur-Assay gleich ist, wenn nicht empfindlicher als RT-PCR 7 und versorgt uns mit Virusisolate, dass in unserer Referenz-Sammlung für zukünftige Studien gespeichert werden. Dennoch kann Zellkultur-Systeme nicht angemessen in vielen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken für die wichtigen Beiträge der Drs. John Anderson, Andrew Main und Shirley Tirrell zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) und dem US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 und CONH00773) unterstützt.

Materials

Name of reagent/ equipment Company Catalog Number
Fetal bovine serum Gibco – Invitrogen 16140
Anti-biotic/mycotic Gibco – Invitrogen 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. Gibco – Invitrogen 25080
L-Glutamine 200mM 100x Gibco-Invitrogen 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) Gibco – Invitrogen 11700
10X Dulbecco’s PBS Gibco – Invitrogen 14080
Trypsin-EDTA Gibco – Invitrogen 15400
Rabbit serum Gibco – Invitrogen 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

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Cite This Article
Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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