Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys
Summary
Vi beskriver en metod att bearbeta och skärm fältet samlas in myggor för en mångfald av virus genom att Vero cellodling analys. Genom att använda denna teknik har vi upptäckt 9 olika virus från 4 taxonomisk familjer i myggor samlats i Connecticut.
Abstract
Myggor överföra ett antal olika virus, inklusive viktiga mänskliga patogener som West Nile virus, denguefeber virus och chickungunya virus. Många av dessa virus har intensifierats i endemiska områden och utvidgas till nya områden, vilket kräver effektiv övervakning och kontroll program för att möta dessa hot. En strategi för att övervaka virusaktivitet skall hämtas stort antal myggor från endemiska områden och testa dem för virusinfektion. I den här artikeln beskriver vi hur man hantera, bearbeta, och skärmen på fältet in myggor för smittsamma virus genom Vero cellodling analys. Myggor är sorterade efter fälla plats och arter, och grupperas i pooler innehåller ≤ 50 individer. Poolade prover homogeniseras i buffrad saltlösning med en mixer-kvarn och vattenfasen är ympas konfluenta Vero cellkulturer (Clone E6). Cellkulturer övervakas för cytopatisk effekt från dagar 3-7 efter ympning och eventuella virus odlas i cellkulturer identifieras genom lämpliga diagnostiska tester. Genom att använda denna metod, har vi isolerat 9 olika virus från myggor samlats in i Connecticut, USA, och bland dessa finns 5 kända för att orsaka sjukdomar hos människan. Tre av dessa virus (West Nile-virus, Potosi virus, och La Crosse-virus) är nya rekord för Nordamerika eller New England sedan 1999. Förmågan att upptäcka en mångfald av virus är avgörande för att övervaka både etablerade och nytillkomna virus i mygga befolkningen.
Protocol
Discussion
Vero-cellodling-analysen fungerar som en effektiv metod att sålla fält-in myggor för en mångfald av virus. Detta står i kontrast till molekylära metoder som specifikt riktar en eller ett fåtal virus av intresse. Dessutom har vi funnit att Vero cellkultur analysen är lika om inte mer känsliga än RT-PCR-7 och ger oss virusisolat som lagras i vår referenssamling för framtida studier. Trots detta kan cellodling system inte lämpligt i många fall. Detta tillvägagångssätt medför merkostnader och ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner tacksamt de viktiga bidragen från Dr. John Anderson, Andrew Main och Shirley Tirrell till denna studie. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från Center for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) och US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 och CONH00773).
Materials
| Name of reagent/ equipment | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Fetal bovine serum | Gibco – Invitrogen | 16140 |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco – Invitrogen | 15240 |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | Gibco – Invitrogen | 25080 |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | Gibco – Invitrogen | 11700 |
| 10X Dulbecco’s PBS | Gibco – Invitrogen | 14080 |
| Trypsin-EDTA | Gibco – Invitrogen | 15400 |
| Rabbit serum | Gibco – Invitrogen | 16120 |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353112 |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353108 |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper’s hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. . International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
