Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Summary

Nous présentons une technique lentiviraux pour la manipulation génétique et la visualisation de simples axone neurone olfactif sensorielle et son arborisation terminale<em> In vivo</em>.

Abstract

Développement d'un circuit précis olfactive repose sur la projection précise de olfactifs sensoriels neurone (SVO) axones vers leurs cibles synaptiques dans le bulbe olfactif (OB). Les mécanismes moléculaires de l'OSN axone de croissance et de ciblage ne sont pas bien comprises. L'expression des gènes Manipulation et après la visualisation des axones OSN unique et leur terminal tonnelle morphologie ont été jusqu'à présent difficile. Pour étudier la fonction des gènes au niveau cellulaire unique dans un délai déterminé, nous avons développé une technique basée lentiviraux de manipuler l'expression des gènes dans les ARS in vivo. Particules Lentivirales sont livrés à ARS par microinjection dans l'épithélium olfactif (EO). Des cassettes d'expression sont alors définitivement intégré dans le génome des ARS transduites. Vert l'expression des protéines fluorescentes identifie ARS infectés et expose leur morphologie entier, y compris la tonnelle axone terminal. Grâce au temps de retournement court entre la micro-injection et la détection journaliste, les études de fonction du gène peut être porté dans un délai très étroite du développement. Avec cette méthode, nous avons détecté expression de la GFP dans aussi peu que trois jours et aussi longtemps que trois mois après l'injection. Nous avons atteint deux sur-expression et de médiation shRNA le knock-down par microinjection lentiviraux. Cette méthode fournit des morphologies détaillées des corps cellulaires et des axones OSN au niveau cellule unique in vivo, et permet ainsi la caractérisation de la fonction de gènes candidats au cours du développement olfactif.

Protocol

1. Préparation Cette procédure est la biosécurité de niveau 2, donc toutes les préparations suivantes sont faites dans une hotte Biohazard où la procédure de micro-injection est réalisée. Préparer et préchauffer à 37 ° C à eau: Remplissez un sac de rangement en plastique avec de l'eau – joint et mis sur un bloc de chauffage vidé incubateur. Cela permettra de récupérer les souris après l'injection. Remplissez un récipient avec les déch…

Discussion

Microinjection des résultats lentivirus dans le transfert permanent de constructions de gènes dans l'ADN génomique OSN. Cette approche nous permet d'effectuer des manipulations à court terme ou à long terme de gènes candidats par surexpression ou la médiation shRNA le knock-down. En outre, nous pouvons par fluorescence étiquette ARS unique dans une lignée de souris transgéniques existantes pour observer la co-localisation des populations de récepteurs olfactifs. La microinjection est requis pour la tr…

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).

Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.

Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.