Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays
Summary
Die Quantifizierung der HIV-1 RNA im Plasma und Sequenzierung einzelner HIV-1 Genome von Individuen mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze (50-75 Kopien / ml) ist schwierig. Hier beschreiben wir, wie zu extrahieren und zu quantifizieren, Plasma-Virus-RNA mit Hilfe eines Echtzeit-PCR-Assay, der zuverlässig misst HIV-1 RNA bis zu 0,3 Kopien / ml und wie man virale Genome von einzelnen Genomsequenzierung verstärken, von Proben mit sehr niedrigen Viruslast.
Abstract
Amplifikation viraler Gene und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-1 infizierten Patienten mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von Standard-Tests (unter 50-75 Kopien / ml) ist notwendig, um einen Einblick zu viralen Dynamik und Virus Wirt-Interaktionen zu gewinnen bei Patienten, die natürlich Kontrolle der Infektion und diejenigen, die auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie (cART) sind.
Hier beschreiben wir, wie man virale Genome von einzelnen Genoms (die SGS-Protokoll) 13, 19 und wie genau quantifizieren HIV-1 RNA bei Patienten mit niedrigen Viruslast (die Single-Copy-Test (SCA)-Protokoll) 12, 20 zu verstärken.
Die Single-copy-Assay ist ein real-time PCR-Assay mit Empfindlichkeit in Abhängigkeit vom Volumen des Plasmas untersucht. Wenn ein einzelner Virus-Genom in 7 ml Plasma erkannt wird, dann ist die RNA-Kopienzahl gemeldet zu 0,3 Kopien / ml liegen. Der Test hat ein internes Kontrollsystem Tests für die Effizienz der RNA-Extraktion und Steuerungen für möglich Amplifikation aus DNA oder Verunreinigung. Patientenproben sind in dreifacher Ausfertigung gemessen.
Die Single-Genom-Sequenzierung Assay (SGS), mittlerweile weit verbreitet und als nicht arbeitsintensiv 3, 7, 12, 14, 15, ist ein limitierender Verdünnung Assay, in dem Endpunkt verdünnten cDNA Produkt über einen 96-Loch verteilt Platte. Laut einer Poisson-Verteilung, wenn weniger als 1 / 3 der Brunnen Produkt geben, gibt es eine 80% ige Chance, das PCR-Produkt wird resultierenden Verstärkung von einer einzigen cDNA-Molekül. SGS hat den Vorteil, über das Klonen von nicht zu Resampling unterzogen und nicht durch PCR eingeführt Rekombination 19 vorgespannt. Allerdings hängen die Verstärkung Erfolg von SCA und SGS auf Primer-Design. Beide Tests wurden für HIV-1 Subtyp B entwickelt, kann aber für andere Subtypen und anderen Regionen des Genoms, indem Primer, Sonden und Standards angepasst werden.
Protocol
Discussion
HIV-1 infizierten Personen auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie behandelt (cART) oder die natürlich kontrollieren die Infektion haben eine sehr niedrige Viruslast, typischerweise etwa 1 Exemplar pro ml Plasma 4, 11, 12, 17, 18. Viruslast bei Patienten mit natürlichen Kontrolle, oft um einen individuellen Sollwert 1, 2, 17 schwanken. Die Empfindlichkeit des hier beschriebenen Tests ist stark abhängig von der Eingabe Volumen von Plasma. Generell haben wir mit 7 ml Plasma gearbeitet, abe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Patienten, die in den zahlreichen Studien von HIV-1 beteiligt zu bestätigen.
JMC war ein Research Professor der American Cancer Society mit Unterstützung der FM Kirby Foundation.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Strategene | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | Gibco/Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 |
| Name of Euipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | any | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | ||
| 1 ml centrifuge tubes | any | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorval | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collection tubes any brand
References
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O’Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
- Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O’Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, . Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
- Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O’Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
- Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. a. n., Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
- Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
- Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
- Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
- Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
- Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
- Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e., Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
- Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
- Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
- Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
- Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
- Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
- Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
- Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
- Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
- Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).
