Summary

Усиление и Количественная РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения стандартными клиническими Анализы

Published: September 26, 2011
doi:

Summary

Количественная уровней РНК ВИЧ-1 в плазме крови и последовательности одного ВИЧ-1 генома от лиц с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения (50-75 копий / мл) трудно. Здесь мы опишем, как извлечь и количественной вирусной РНК с помощью ПЦР в реальном времени анализ, который надежно измеряет РНК ВИЧ-1 до 0,3 копий / мл и как усилить вирусных геномов путем секвенирования генома одного из образцов с очень низкой вирусной нагрузкой.

Abstract

Усиление вирусных генов и количественной оценки РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-1-инфицированных пациентов с вирусной нагрузкой ниже предела обнаружения стандартные анализы (ниже 50-75 копий / мл) необходимо, чтобы разобраться с вирусной динамики и взаимодействия вируса принимающей у пациентов, которые Естественно борьбы с этой инфекцией, и те, которые находятся на комбинированной антиретровирусной терапии (ВОЗ).

Здесь мы опишем, как для усиления вирусных геномов одиночными секвенирование генома (SGS протокола) 13, 19 и, как точно количественно РНК ВИЧ-1 у пациентов с низкой вирусной нагрузки (одной копией анализа (SCA) протокол) 12, 20.

Одной копии анализа является ПЦР в реальном времени анализа с чувствительностью в зависимости от объема плазмы быть проанализированы. Если одного генома вирус обнаружен в 7 мл плазмы, то количество РНК копия, как сообщается, 0,3 копий / мл. Анализ имеет внутреннее тестирование для контроля эффективности добычи РНК, а также контроль за возможным усилением из ДНК или загрязнения. Образцы пациентов измеряются в трех экземплярах.

Одной секвенирование генома анализа (SGS), теперь широко используется и считается без трудоемких 3, 7, 12, 14, 15, предельного разбавления пробы, в которых конечная точка разбавленный кДНК продукт распространяется на 96-луночного пластины. Согласно распределению Пуассона, когда менее чем 1 / 3 от скважины дают продукт, существует 80% вероятности продукт ПЦР будучи равнодействующей усиления из одной молекулы кДНК. SGS имеет преимущество по сравнению с клонированием не подвергается передискретизации, а не в предвзятости при помощи ПЦР введенные рекомбинации 19. Тем не менее, усиление успех SCA и SGS зависит от грунтовки дизайна. Оба были разработаны анализы на ВИЧ-1 подтипа Б, но могут быть адаптированы для других подтипов и других регионов генома, изменяя грунтовки, зонды, и стандартами.

Protocol

1. Добыча РНК из больших объемов плазмы Обзор одного анализа копию (SCA) и одного секвенирование генома (SGS) протокола предоставляются на рисунках 1 и 2. Чтобы получить 7 мл плазмы, спин примерно 14 мл крови, собранных в 15 мл ЭДТА (не гепарин) сбор труб при 2600 мкг в течение 15 …

Discussion

ВИЧ-1-инфицированных лиц на комбинированной антиретровирусной терапии (ВОЗ), или которые, естественно, контроль инфекции имеют очень низкую вирусную нагрузку, как правило, около 1 экземпляру на каждый мл 4 плазмы, 11, 12, 17, 18. Вирусная нагрузка у пациентов с естественным контролем, час…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают, пациенты, которые принимали участие в многих исследованиях ВИЧ-1.

СВК был профессор-исследователь из Американского онкологического общества при поддержке FM Кирби Foundation.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue number Comments
Random hexamers (500 ug/ml) Promega C118A  
Taqman buffer A Applied Biosystems 4304441  
RNAsin (40 U/ul) Promega N211B  
RT enzyme (200 U/ul) Strategene 600107-51  
Amplitaq Gold DNA polymerase Applied Biosystems 4311814 6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM Invitrogen AM9855G  
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul Invitrogen 18080-044  
Superscript III 10X buffer Invitrogen   comes with the enzyme
DTT 100 mM Invitrogen   comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul Invitrogen 11304-102  
10X High Fidelity PCR Buffer Invitrogen 11304-102 comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml Ambion 2546  
Guanidinium Thiocyanate solution 6M FlukaBiochemica 50983  
Glycogen 20 mg/ml Roche 10901393001  
Isopropanol Sigma-Aldrich 19516  
Ethanol 70% Sigma-Aldrich E702-3  
Molecular grade water Gibco/Invitrogen 10977-015  
dNTPs (25 mmol each) Bioline BIO-39025  
Name of Euipment Company Catalogue number Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) Seaton Scientific 6041  
White Delrin crowns Seaton Scientific 4020 Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml Beckman 361642  
Hex driver ½ inc opening Seaton Scientific 4013  
cap removal tupe Seaton Scientific 4014  
5 ml serological pipettes Costar 4051  
Pipetboy any    
15 ml Transfer pipettes ISC Bioexpress P-5005-7  
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip VWR 14670-329  
15 ml centrifuge tubes Falcon    
1 ml centrifuge tubes any    
Tris buffer Saline tablets Sigma-Aldrich T5030-100TAB  
Ultracentrifuge and rotor Sorval 90SE and T-1270  
96-well PCR plates Biorad HSS-9601  
50 ml Reagent reservoir Costar 4870  
Microamp optical 96-well reaction plate Applied Biosystems N801-0560  
Optical plate covers Applied Biosystems 4333183  
MicroAmp Optical Compression Pad Applied Biosystems 4312639  
Microseal A film Biorad MSA-5001  
2 ml centrifuge tubes Any    
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) Invitrogen G-7008-01  
E-base (Invitrogen) Invitrogen EB-M03  

EDTA Collection tubes any brand

References

  1. Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O’Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
  2. Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
  3. Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O’Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, . Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
  4. Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O’Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
  5. Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. a. n., Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
  6. Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
  7. Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
  8. Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
  9. Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
  10. Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
  11. Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e., Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
  12. Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
  13. Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
  14. Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
  15. Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
  16. Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
  17. Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
  18. Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
  19. Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
  20. Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).

Play Video

Cite This Article
Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A., Spindler, J., Maldarelli, F., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays. J. Vis. Exp. (55), e2960, doi:10.3791/2960 (2011).

View Video