Инозитол пирофосфаты играют важную роль в человеческой патологии, такие рака, диабета и ожирения, однако точный механизм действия является предметом спора. Отсутствие коммерчески доступных инозитол пирофосфаты предоставляет детальные исследования проблематично. Здесь мы опишем простой протокол для производства и изолировать мг инозитол пирофосфаты.
Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.
Использование инозитол пирофосфата в биохимии сильно ограничена коммерческой отсутствия таких соединений и низкой чувствительности существующих методов обнаружения. Сочетание PAGE, который позволяет разделение молекул, имеющих разное количество фосфатных групп, и толуидиновым синим (рис. 1), метахроматическая краситель, который связывается с фосфатными группами, позволяет легко обнаружения инозитол изоформ pyrophoshate открывая новые направления исследований 20.
Описано использование технологии СТРАНИЦА, чтобы очистить инозитол продуктов пирофосфат ферментативной реакции осуществляется outby либо ИП 6 K1 или VIP1 это простой, экономичный и надежный метод, который позволяет для производства большого количества высоких IP качества 7. Описанный выше метод не ограничивается простой очистки IP-7, но незначительные изменения описанного протокола может позволить очистки различный диапазон инозитол пирофосфаты. Высшее фосфорилированных инозитол изоформ пирофосфат, содержащие более восьми фосфатные группы могут быть обнаружены с помощью IP-7 или различное количество IP-6 в качестве подложки 20,6. Эти инозитол пирофосфаты могут быть обнаружены путем увеличения длины Процедура окраски, а затем очищенный (раздел 3.2). Более того, использование IP-5 в качестве субстрата для ферментативной реакции позволит очистки PP-IP-5 и других инозитол пирофосфаты содержащие гидроксильные группы по инозитол кольцо.
В заключение этого нетребовательного метод позволяет надежной очистки миллиграмм количествах инозитол пирофосфаты с широко доступных инструментов, тем самым открывая новые перспективы для этой захватывающей области исследований.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим А. Риччио за полезные комментарии и прочитать рукопись. Эта работа была поддержана Советом по медицинским исследованиям (MRC) финансирования в отдел клеточной биологии и по правам пограничной науки Программа Грант (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |