Summary
在一个活的动物研究干细胞分化的一个有吸引力的模式是涡虫扁虫。再生是由简单的截肢手术,很容易在一个基本的实验室进行的实验研究和药理学和基因(适合
Abstract
自由生活涡虫扁虫有一个历史悠久的实验使用,因为他们非凡的再生能力 1 。从这些动物切除的小片断,改革原体计划,缺少的车身结构的再生。例如,如果一个“主干”的片段是从一个完整的蠕虫切割,一个新的“头”将再生前方一个“尾巴”后方将重新恢复了原有的“头部到尾部的车身结构的极性截肢前(图1A)。
涡虫被称为“neoblasts'〜30种不同类型的细胞分化,在正常的身体动态平衡和执行组织再生的干细胞,是由再生。这种再生过程是可靠和容易证明。由于几个创业实验室,许多工具和功能基因的方法的奉献精神,现在已经为这个模型系统进行了优化。因此,相当最近已经取得了进展,在理解和操作基础 2-9涡虫的发育可塑性的分子事件。
涡模型系统将会以一个科学家的广泛利益。神经学家,模型给予机会研究整个神经系统的再生,而不是简单的再生/修复单个神经细胞的过程中,通常是在许多已建立的模型研究的重点。涡虫表达的神经递质10过多,代表的一项重要制度,为研究中枢神经系统的11,12的演变,行为甄别潜在的13,14 。
再生的结果是经得起药理和遗传apparoaches操纵。例如,可以进行筛选药物对再生的影响,只需放置在身体片段的药物含截肢后在不同时间点的解决方案。使用击倒方法( 在体内的RNAi),这可以实现,通过显微注射周期或喂食细菌表达双链RNA的结构8,9,15,可以研究单个基因的作用。这两种方法都可以产生高外显率,例如,双极动物16-21再生的视觉冲击的表型。为了便于采用这种模式和实施这种方法,我们将展示使用涡虫日本三角涡虫的药理学和基因检测(在体内RNAi技术通过喂食)的视频在这条协议。
Protocol
1。中继片段再生实验
- 再生实验前至少5天停喂的蠕虫病毒的队列,以确保动物废物和摄取食物(30〜完整的蠕虫,每个蠕虫〜8-10毫米长的饥饿后)的。
- 在检测的一天,冲洗与水预先冷冻的平整的冰盘,并用保鲜膜覆盖平的冰面。使用镊子,一个滤纸上的保鲜膜。
- 几滴泉水浸湿的滤纸。转移到过滤器使用的移液管(<20%过滤蠕虫)涡虫。蠕虫过滤器,如果有必要可以重新定位,通过与更多的泉水repipetting。删除多余的液体。
- 使用手术刀,截肢动物的前尖,咽( 图1A)前结束之间约中途一个单切头。
- 使用手术刀,截去尾部区域,由一个单一的削减约中间动物的尾部和后咽( 图 1A)结束。删除多余的粘液,用手术刀切割后蘸用70%乙醇的纸巾。用手术刀多余的乙醇。
- 转移到培养皿中(100 x 25毫米深)通过含有泉水钳过滤器。等待〜3分钟(伤口缝合,观察一个捏和伤口变黑)。
- 冲洗干净,滤纸的Petri菜含有所需再生法和转移到恒温培养箱(24℃)介质的主干片段。
- 分数再生表型〜1周后,当再生结构识别( 图 1A) 。
2。吡喹酮诱导再生:两极药理操纵
- 准备溶药物在DMSO(62.4mg 1ML PZQ 200MM股票)吡喹酮(PZQ)的股票。当天使用。
- 设为50毫升含药溶液中缓冲Montjuch盐(PZQ 90微米)。涡〜1分钟,以确保分散。
- 执行主干片段[#1],露出的树干碎片队列的最后一步[1.7] PZQ协议的详细以上的再生法。
- 24-48小时后,交换PZQ含有温泉水的媒体,洗衣机蠕虫(> 3)次。
- 返回蠕虫孵化器。分数两极(两个头, 图1B)切割后的一周。
3。再生的基因操作:在体内RNAi的喂养协议
- 检测前,准备鸡肝匀浆。丢弃从foodstock脂肪,黄颜色的部分,菜泥其余肝。过滤菜泥通过滤网和存储等分悬浮液(1.5ml离心管,-20℃)。
- 检测之前,准备aliquoting到1ML样品供应,储存于-20 ° C牛的红血细胞(红细胞)
- 选择用于RNAi的蠕虫病毒。三个同伙:感兴趣的基因,阳性对照组(基因与已知的RNA干扰表型;图1C,D和 E)和负控制(无RNAi的表型的基因,也有用的评估击倒水平相比,实验队列)。对于每个队列,使用〜250的蠕虫(〜8-10毫米长至少5天的饥饿后)。存放在塑料桶泉水。
- 对于每个RNAi的队列中,大肠杆菌表达dsRNA的目标感兴趣的基因大肠杆菌解冻股票[8],随着鸡肝匀浆管[3.1]和红细胞管[3.2]。
- 佩莱细菌(13000克,1分钟)。移除上清液2xYT媒体(〜700μl)和重新悬浮颗粒。 Recentrifuge,在冰上,丢弃上清液,沉淀的地方。
- 创建大缸径P200的枪头,切断提示结束。在鸡肝匀浆(150μL)和红细胞(50μL)的混合物创建RNAi的喂养混合彻底重悬细菌沉淀。取出离心中的气泡。
- 觅食,删除包含蠕虫的塑料浴盆的水多数(离开〜1英寸深入)。涡流浴缸集中在这个容器中的中心的蠕虫,和吸管RNAi在一个网罗蠕虫圈饲养的组合。请使用移液管,仔细同轴电缆上的RNAi喂养混合逃出,没有其他食客的干扰!
- 喂奶后(约1小时),确定,美联储以及涡虫。这些蠕虫从摄入的红细胞深红色着色。丢弃他人。
- 小心地更换新鲜的泉水喂养的解决方案,最大限度地减少干扰,防止食物的排泄。要做到这一点,轻轻地本地化蠕虫使用移液管的管的一侧,倒入水混浊,并仔细地用清水取代倾盆而下的浴缸对面的墙上。长时间暴露在空气Resubmerge涡虫很快也会导致食物排泄。
- 松散SE铝容器的盖子,并返回到培养箱(24℃)
- 重复RNAi在多个周期中喂养协议(〜2-3天),穿插协议#1]屏幕RNAi的表型再生周期。许多基因的有效供料和再生的一个标准协议显示在图2〜1个月,总工期。
修改这个计划,针对不同的基因作为最佳的协议将取决于mRNA的稳定性,组织定位,蛋白质perdurance,或排除多个喂养周期后再生一个表型的发展等因素。评估只是表型的显性筛选(明显),或定量PCR方法,有针对性的mRNA水平与阴性对照队列击倒水平。
4。代表性的成果:
主干片段再生实验是健壮的所有蠕虫应重新正常前后(“头到尾”)极性。这可以切割后的5天,前眼点(asterixed图1A)的出现,促成尽快拿下。然而,一周后完成恢复失去结构的形态发生。药理操纵主干片段再生PZQ产量双头蠕虫( 图1B)也很强大(欧共体50 = 87(+ - )11%的双极片段,70μM为48 小时 20 PZQ) 。两极发生在一个单一的再生周期。下在这些实验的疗效可能与药物的溶解度和/或存储,或使用不同的扁虫种PZQ是无效的问题。对于外显率较 低的药物,通常用于anteriorization指数得分从 22完整的两极的中间表型搁置。表型从积极的控制结构的RNAi, 如图1所示:RNAi 的日本三角涡虫6 - 1(D J六个- 1)的结果,在无眼表型23( 图 1C),日本三角涡虫的PC2的RNAi(DJ - PC2)在损失厌恶的光响应24( 图1D)和RNAi的结果, 日本三角涡虫βcatenin- 1(βcateninDJ - 1)的结果在两个为首的表型16-19日,从主干片段( 图1E)21。这些表型,可以实现用下面这个简单的RNA干扰协议:DJ -六(FFxFx),DJ - PC2(FFFx),DJ -βcatenin- 1(FFxFx),其中F =饲养周期和x =分别再生周期。
图1:主干片段再生检测涡虫(上)和原理图(中) 左 ,形象地展现切除主干片段的位置。右键,躯干片段再生timecourse显示外观再生片段在指定的时间(天)乙PZQ曝光产生。双头涡虫的图像C“无眼”DJ -六- 1 RNA干扰,D动的DJ - PC2的RNAi蠕虫(染成红色)轻厌恶反应,亏损相比,移动控制蠕虫(染色产生的蠕虫绿色),E双极型涡虫的DJ -βcatenin1的RNAi 。在Be,原来的RNAi蠕虫前到底是面向左侧。
图2:典型RNAi的协议包括多个喂养(F)和再生周期(X)是有效的 D.许多基因敲除喂养和切割周期序列粳稻 。本议定书的个体基因可能需要修改,以产生最佳的结果,使用例如一个较少(括号)或更大数量的喂养和再生周期。
Discussion
这里描述协议详细分析,研究和操纵涡虫三角涡虫再生的粳稻。他们很简单,不需要专用设备等,他们可以很容易地在实验室或教室进行。分析可以单独进行,或合并化学药物药效在体内的基因筛查,可以在候选基因水平上进行,或适应无偏见的,高通量筛选 8 。无论是耐人寻味的涡虫的生物学研究自己的权利,或在体内功能在哺乳动物的同源性研究组织再生的替代模型的评估,这些方法应推动多元化的研究人员的兴趣。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在实验室的工作是由NSF(MCB0919933)和国立卫生研究院(GM088790)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple Suppliers | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
Plastic tub: Ziploc Twist ’n Loc (16oz). | Various | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
Hand Blender | Any Supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
Wire 1mm Mesh strainer | Any Supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
Circular filter papers | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
Sterile, surgical blades | Multiple Suppliers | n/a | |
±Praziquantel | Sigma-Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |
References
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