Intraspinale Cel Transplantatie voor Targeting Cervicale ventrale hoorn van Amyotrofische Lateraal Sclerose en traumatisch ruggenmergletsel
Summary
Neurale voorloper transplantatie is een veelbelovende strategie voor de bescherming en / of vervangen van verloren / disfunctionele cervicale diafragma motorische neuronen in het ruggenmerg letsel (SCI) en de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS). Wij bieden een protocol voor de cel levering aan cervicale ruggenmerg ventrale hoorn in knaagdiermodellen van ALS en SCI.
Abstract
Respiratoire compromis te wijten aan diafragma motor neuron verlies is een slopende gevolg van een groot deel van de menselijke traumatisch ruggenmergletsel (SCI) gevallen 1 en is de uiteindelijke oorzaak van de dood bij patiënten met de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS) 2.
ALS is een verwoestende neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door relatief snelle degeneratie van de bovenste en onderste motorische neuronen. Patiënten die uiteindelijk bezwijken aan de ziekte van gemiddeld 2-5 jaar na de diagnose als gevolg van verlamming van de ademhalingsspieren te wijten aan het verlies van diafragma motorneuron innnervation van het membraan 3. De overgrote meerderheid van de gevallen zijn sporadisch, terwijl 10% zijn van de familiale vorm. Ongeveer twintig procent van de familiale gevallen gekoppeld aan verschillende puntmutaties in het Cu / Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gen op chromosoom 21 4. Transgene muizen en ratten 4,5 6 uitvoeren mutant SOD1 menselijke genen (G93A, G37R, G86R, G85R) zijn gegenereerd, en, ondanks het bestaan van andere diermodellen van de motor neuron verlies, zijn op dit moment de meest gebruikte modellen van de ziekte .
Ruggenmergletsel (SCI) is een heterogene set van voorwaarden die voortvloeien uit fysiek trauma aan het ruggenmerg, met functionele resultaat varieert naar gelang van het type, de locatie en de ernst van het letsel 7. Toch is ongeveer de helft van de menselijke SCI gevallen invloed hebben op cervicale regio's, resulterend in slopende respiratoire dysfunctie als gevolg van diafragma motor neuron verlies en schade aan dalende bulbospinal luchtwegen axonen 1. Een aantal diermodellen van SCI zijn ontwikkeld, met de meest gebruikte en klinisch relevante zijnde de kneuzing 8.
Transplantatie van verschillende klassen van neurale voorloper cellen (NPC) is een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van traumatische CNS verwondingen en neurodegeneratie, waaronder ALS en SCI, vanwege de mogelijkheid om verloren of disfunctionele CNS celtypen, om te voorzien neuroprotectie vervangen, en leveren gen factoren van belang 9.
Diermodellen van zowel ALS en SCI kan het model een groot aantal klinisch relevante aspecten van deze ziekten, met inbegrip van diafragma motorneuronen verlies en daaruit voortvloeiende respiratoire compromis 10,11. Om de effectiviteit van NPC-gebaseerde strategieën op respiratoire functie in deze dierlijke modellen van ALS en SCI te evalueren, moet cellulaire interventies specifiek gericht zijn op gebieden met therapeutisch relevante doelstellingen, zoals diafragma motorneuronen. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor multi-segmentale, intraspinale transplantatie van NPC's in het cervicale ruggenmerg ventrale grijze stof van neurodegeneratieve modellen zoals SOD1 G93A muizen en ratten, maar ook ruggemerglaesie ratten en muizen 11.
Protocol
Discussion
Voor studies met SOD1 G93A muizen en ratten, leeftijd en geslacht overeen met de dieren binnen een groep, en dieren binnen hetzelfde nest aan verschillende groepen te verdelen. Het is beter om alle dieren te gebruiken van hetzelfde geslacht voor zowel ALS en SCI-modellen, omdat de ziekte-processen kunnen verschillen tussen mannen en vrouwen, maar het kan ook nuttig zijn om genoeg dieren van beide geslachten om mogelijke sekse-specifieke effecten te detecteren hebben, zoals dit fenomeen is gemeld bij SOD1 <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik wil graag bedanken: alle leden van de Lepore, Maragakis en Rothstein labs voor nuttige discussie; De Paralyzed Veterans of America en de Craig H. Neilsen Foundation voor financiering.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
| HBSS | Gibco | 14170 |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300 |
| Soybean Trypsin Inhibitor (optional) | Sigma | T-6522 |
| Acepromazine maleate (0.7 mg/kg) | Fermenta Animal Health | |
| Ketamine (95 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Bayer | |
| #11 Feather surgical blade | Electron Microscopy Sciences | 72044-11 |
| Cotton-tipped applicators (6 inch) | Fisher | 23-400-101 |
| Rat-toothed forceps | Fine Science Tools | Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 |
| Medium-sized spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 |
| Mini spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 |
| Rongeur | Fine Science Tools | Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 |
| Microknife | Fine Science Tools | 10056-12 |
| Needle holders | Fine Science Tools | 12502-14 |
| Suture: 4-0 | Vicryl | S-183 |
| Staples: 9 mm | Autoclip | 427631 |
| Stapler: 9 mm (Reflex #203-1000) | World Precision Instruments | 5000344 |
| Warm water pump (T/Pump) | Gaymar | P/N 07999-000 |
| Cyclosporin A: 250.0 mg/5.0 mL ampules | Novartis/Sandimmune | NDC 0078-0109-01 |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 |
| Injector | World Precision Instruments | UMP2 |
| Micro 4 Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMC4 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite-R |
| 10.0 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80030 |
| Hamilton needles: 33-gauge, 45° bevel, 1 inch | Hamilton | 7803-05 |
| Glass 20.0 μL microcapillary pipettes (optional) | Kimble | 71900-20 |
References
- Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).
- Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P., Davis, F. A. . Amyotrophic lateral sclerosis. , (1998).
- Tandan, R., Bradley, W. G. Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis. Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).
- Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 59-59 (1993).
- Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-327 (1997).
- Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Howland, D. S., Liu, J., She, Y. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).
- Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease. J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).
- McDonald, W., Becker, D. Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals. Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).
- Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury. Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1433 (2000).
- Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).
- Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature. 11, 1294-1294 (2008).
- Rao, M. S. Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System. Anat Rec. 257, 137-137 (1999).
- Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells. Dev Biol. 188, 48-48 (1997).
- Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain research. 1185, 256-256 (2007).
- Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS. Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).
- Shumsky, J. S., Lepore, A. C. Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry. J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).
