Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em
Summary
We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.
Abstract
Veel eukaryote cellen kan detecteren hellingen van de chemische signalen in hun omgeving en migreren dienovereenkomstig 1. Deze begeleide cel migratie wordt genoemd als chemotaxis, die essentieel is voor de verschillende cellen om de uitvoering van hun functies, zoals handel in immuuncellen en patroonvorming van neuronale cellen 2, 3. Een grote familie van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) detecteert variabele kleine peptiden, bekend als chemokines, naar cel migratie direct in vivo 4. Het uiteindelijke doel van chemotaxis onderzoek is om te begrijpen hoe een GPCR machines zintuigen chemokine gradiënten en controles gebeurtenissen die leiden tot chemotaxis signalering. Daartoe hebben we beeldvormende technieken te gebruiken, in real time, spatiotemporele concentraties van chemoattractants, cel-beweging in een helling van chemoattractant, GPCR gemedieerde activering van heterotrimere G-eiwit, en intracellulaire signalisatie gebeurtenissen die betrokken zijn bij chemotaxis van eukaryote cellen 5-8 . De eenvoudige eukaryotische organisme, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic gedragingen die vergelijkbaar zijn met die van de leukocyten, en D. discoideum is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van eukaryote chemotaxis. Als vrij levende amoeben, D. discoideum cellen delen in rijk medium. Bij de honger, cellen binnen te dringen een ontwikkelingsstoornis programma waarin ze totaal door cAMP gemedieerde chemotaxis naar multicullular structuren te vormen. Veel onderdelen die betrokken zijn bij chemotaxis naar het kamp zijn geïdentificeerd in D. discoideum. De binding van cAMP aan een GPCR (car1) induceert dissociatie van heterotrimere G-eiwitten in Gγ en Gβγ subeenheden 7, 9, 10. Gβγ subeenheden activeren Ras, die op hun beurt activeert PI3K, PIP 2 omzetting in PIP 3 op het celmembraan 11-13. PIP 3 dienen als bindingsplaatsen voor eiwitten met pleckstrin Homologie (PH) domeinen, waardoor werven deze eiwitten aan het membraan 14, 15. Activering van car1 receptoren controleert ook het membraan verenigingen van PTEN, die PIP 3 dephosphorylates aan PIP 2 16, 17. De moleculaire mechanismen zijn evolutionair geconserveerd in chemokine GPCR-gemedieerde chemotaxis van menselijke cellen zoals neutrofielen 18. Wij presenteren volgende methoden voor het bestuderen van chemotaxis van D. discoideum cellen. 1. Voorbereiding van chemotactische component cellen. 2. Imaging chemotaxis van cellen in een cAMP verloop. 3. Het bewaken van een GPCR geïnduceerde activatie van heterotrimere G-eiwit in een levende cellen. 4. Imaging chemoaantrekkende-triggered dynamische PIP 3 antwoorden in enkele levende cellen in real time. Onze ontwikkelde beeldvormende technieken kunnen worden toegepast op chemotaxis van menselijke leukocyten te bestuderen.
Protocol
Discussion
De processen van het bereiken van chemotactische bevoegde stadium van de cellen
Voor wild-type D. discoideum cellen, het duurt ongeveer 5 ~ 6 uur pulserende ontwikkeling bij kamertemperatuur om ze te bewegen tot een goed chemotactische bevoegde fase waarin cellen weer een goed gepolariseerd cellulaire morfologie en de snelle celmigratie (afb. 1). Verschillende factoren, zoals de cAMP concentratie voor pulserende, temperatuur, en verschillende genetische achtergronden, van invloed kunne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de intramurale fonds uit NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3′ kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 .
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
