Изображений G-белком рецептор (GPCR)-опосредованной сигнализации События, управления хемотаксис Dictyostelium Discoideum</em
Summary
Здесь мы описываем подробные изображения живой клетки методы исследования хемотаксиса. Мы представляем флуоресценции микроскопических методов контроля пространственно-временной динамике сигнальных событий в мигрирующих клетках. Измерение сигнальных событий позволяет нам понять, как дальше GPCR-сети сигнализации достигает градиент зондирования хемоаттрактантов и контролирует направленного миграции эукариотических клеток.
Abstract
Многие эукариотических клетках может обнаружить градиенты химических сигналов в своей среде и мигрировать соответственно 1. Это руководствоваться миграции клеток называется как хемотаксис, что очень важно для различных клеток для выполнения своих функций, таких как торговля иммунных клеток и структурирование нервных клеток 2, 3. Большое семейство G-белком рецепторы (GPCR) обнаруживает переменную небольшие пептиды, известные как хемокины, направить миграции клеток в естественных условиях 4. Конечной целью исследования хемотаксиса чтобы понять, как машины GPCR чувств хемокинов градиенты и контроля сигнализации событий, приведших к хемотаксис. С этой целью мы используем методы визуализации для мониторинга в режиме реального времени, пространственно-временной концентрации хемоаттрактантов, сотовые движения в градиенте хемоаттрактант, GPCR опосредованной активации гетеротримерные G-белком, и внутриклеточных сигнальных событий, участвующих в хемотаксис клеток эукариот 5-8 . Простой эукариотических организмов, Dictyostelium discoideum, отображает chemotaxic поведения, которые аналогичны тем, лейкоцитов и D. discoideum является ключевым модельной системой для изучения эукариотических хемотаксис. Как свободно живущих амеб, Д. discoideum клетки делятся в богатой среде. После голода, клетки вступают программа развития, в котором они совокупный через цАМФ-опосредованной хемотаксис сформировать multicullular структур. Многие компоненты, участвующие в хемотаксис в лагерь были определены в D. discoideum. Связывание цАМФ с GPCR (car1) индуцирует диссоциации гетеротримерные G-белков в Gγ и Gβγ подразделения 7, 9, 10. Gβγ подразделения активировать Ras, который, в свою очередь, активирует PI3K, превращая PIP PIP 2 в 3 на клеточной мембране 11-13. PIP 3 служат сайты связывания белков с pleckstrin Гомология (PH) доменов, таким образом, набор этих белков с мембраной, 14, 15. Активация рецепторов car1 также контролирует мембраны объединений PTEN, который dephosphorylates PIP PIP 3 до 2 16, 17. Молекулярные механизмы эволюционно консервативных в хемокинов GPCR-опосредованной хемотаксис клеток человека, такие как нейтрофилы 18. Мы представляем следующие методы исследования хемотаксиса D. discoideum клеток. 1. Подготовка хемотаксиса клетки компонента. 2. Изображений хемотаксис клеток в цАМФ градиента. 3. Мониторинг GPCR индуцированной активации гетеротримерные G-белка в одном живых клеток. 4. Изображений хемоаттрактант запускаемой динамических PIP 3 ответов в одном живых клеток в реальном времени. Наши разработанные методы визуализации могут быть применены для изучения хемотаксиса лейкоцитов человека.
Protocol
Discussion
Процессы идущие хемотаксиса компетентных этапе клетки
Для дикого типа D. discoideum клетки, она занимает около 5 ~ 6 часов пульсирующий развития при комнатной температуре, чтобы побудить их в хорошо хемотаксиса компетентных стадию, при которой клетки дисплей хорошо поляри?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа проводится при поддержке очной фонд из NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3′ kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 .
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
