Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em
Summary
Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.
Abstract
Molte cellule eucariotiche in grado di rilevare gradienti di segnali chimici nei loro ambienti e di conseguenza migrano 1. Questa migrazione delle cellule guidata è denominato come chemiotassi, che è essenziale per varie cellule di svolgere le loro funzioni come il traffico delle cellule immunitarie ed il modello di cellule neuronali 2, 3. Una grande famiglia di proteine G recettori accoppiati (GPCR) rileva variabile piccoli peptidi, noto come chemochine, per dirigere la migrazione delle cellule in vivo 4. L'obiettivo finale della chemiotassi ricerca è quello di capire come un macchinario sensi GPCR chemochine gradienti ei controlli di segnalazione eventi che portano alla chemiotassi. A tal fine, usiamo tecniche di imaging per monitorare, in tempo reale, le concentrazioni di fattori chemiotattici spazio-temporale, il movimento delle cellule in un gradiente di chemiotattico, GPCR mediata eterotrimerica attivazione di proteine G, e gli eventi di segnalazione intracellulare coinvolte nella chemiotassi di cellule eucariotiche 5-8 . L'organismo semplice eucariotiche, Dictyostelium discoideum, display chemotaxic comportamenti che sono simili a quelli dei leucociti, e D. discoideum è un modello di sistema chiave per lo studio chemiotassi degli eucarioti. Come amebe a vita libera, D. discoideum cellule si dividono in media ricchi. Al momento la fame, le cellule entrare in un programma di sviluppo in cui si aggregano attraverso cAMP-mediata chemiotassi per formare strutture multicullular. Molti componenti coinvolte nella chemiotassi di cAMP sono stati identificati in D. discoideum. Il legame di cAMP ad un GPCR (car1) induce la dissociazione di eterotrimeriche G-proteine in Gγ e subunità Gβγ 7, 9, 10. Subunità Gβγ attivare Ras, che a sua volta attiva PI3K, la conversione PIP 2 nel PIP 3 sulla membrana cellulare 11-13. PIP 3 fungono da siti di legame per le proteine con omologia Pleckstrin (PH) domini, in modo da reclutare queste proteine alla membrana 14, 15. Attivazione dei recettori car1 controlla anche le associazioni membrana di PTEN, che defosforila PIP PIP 3 a 2 16, 17. I meccanismi molecolari sono evolutivamente conservati in chemochine GPCR-mediata chemiotassi di cellule umane come i neutrofili 18. Vi presentiamo i seguenti metodi per lo studio della chemiotassi D. discoideum cellule. 1. Preparazione delle cellule componente chemiotattici. 2. Imaging chemiotassi di cellule in un gradiente di cAMP. 3. Monitoraggio di una attivazione indotta GPCR di eterotrimeriche G-proteina in cellule vive sola. 4. Imaging chemoattractant-triggered PIP dinamico 3 risposte a singole cellule vive in tempo reale. I nostri metodi di imaging sviluppato può essere applicato per studiare chemiotassi dei leucociti umani.
Protocol
Discussion
I processi di raggiungere chemiotattici stadio competente delle cellule
Per il tipo selvaggio D. cellule discoideum, ci vogliono circa 5 ~ 6 ore pulsare lo sviluppo a temperatura ambiente per indurli in un pozzo-chemiotattica fase competenti durante il quale le cellule visualizzare una morfologia ben polarizzata cellulare e la migrazione cellulare rapida (Fig. 1). Diversi fattori, quali la concentrazione di cAMP per pulsare, la temperatura e diversi background genetico, posson…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal fondo intramurale dal NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3′ kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 .
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
