Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus
Summary
We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.
Abstract
In reactie op virale infectie, een gastheer ontwikkelt verschillende defensieve reacties, zoals het activeren van aangeboren immuunsysteem signaalwegen die leiden tot antivirale cytokine productie 1,2. Met het oog op de gastheer te koloniseren, virussen zijn obligate om gastheer antivirale respons te omzeilen en signaalwegen te manipuleren. Het ontrafelen van de gastheer-virus interactie zal licht werpen op de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën tegen virale infectie.
Murine γHV68 is nauw verwant aan humane oncogene Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus en Epsten-Barr virus 3,4. γHV68 infectie in laboratoriummuizen biedt een soepel klein diermodel om het gehele verloop van gastheer responsen en virale infectie te onderzoeken in vivo, die niet beschikbaar zijn voor humane herpesvirussen. In dit protocol, presenteren we een panel van methoden voor fenotypische karakterisatie en moleculaire dissectie van gastheer signalering componenten in γHV68 lytische replicatie zowel in vivo en ex vivo. De beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizenstammen maakt de ondervraging van de rol van gastheer signaalwegen tijdens γHV68 acute infectie in vivo. Bovendien kan muis embryonale fibroblasten (MEF) geïsoleerd uit deze deficiënte muizenstammen gebruikt worden om verdere rol van deze moleculen ontleden tijdens γHV68 lytische replicatie ex vivo.
Met virologische en moleculaire biologie assays kunnen we lokaliseren het moleculaire mechanisme van gastheer-virus interacties en identificeren gastheer en virale genen essentieel is voor virale lytische replicatie. Tenslotte een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) verlicht de introductie van mutaties in het virale factor (en) die specifiek onderbreken host-virus interactie. Recombinant γHV68 die deze mutaties kan worden gebruikt om het fenotype van γHV68 lytische replicatie deficiënte MEF's in ontvangst in belangrijke signaleringscomponenten vatten.Dit protocol biedt een uitstekende strategie om gastheer-pathogeen interactie ondervragen op verschillende niveaus van interventie in vivo en ex vivo.
Onlangs hebben we ontdekt dat γHV68 eigent zich een aangeboren immuun signaalweg om virale replicatie lytische 5 te bevorderen. Specifiek γHV68 de novo infectie activeert het immuunsysteem kinase IKKβ en geactiveerd IKKβ fosforyleert de master virale transcriptie factor, replicatie en transactivator (RTA) te bevorderen virale transcriptionele activatie. Daarbij γHV68 efficiënt koppelt haar transcriptionele activering naar aangeboren activering van het immuunsysteem te hosten, en aldus virale transcriptie en lytische replicatie. Deze studie biedt een uitstekend voorbeeld dat kan worden toegepast op andere virussen tot host-virus interactie te ondervragen.
Protocol
Discussion
In reactie op virale infecties, worden de Mavs afhankelijk aangeboren immuunsysteem signaalwegen geactiveerd om de productie van antivirale inflammatoire cytokines 10-14 bevorderen. Met muizen γHV68 als model voor menselijke oncogeen virus Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus en Epstein-Barr virus 3,4 ontdekten we dat γHV68 eigent de Mavs-IKKβ route van virale lytische replicatie via via transcriptionele activatie 5. Gebruikmakend genetisch gemodificeerde MEFs en technieken in mole…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr James (Zhijian) thank Chen (UT Southwestern, Moleculaire Biologie) voor het verstrekken van essentiële reagentia, met inbegrip van de Mavs – / – muizen, en Dr Ren Sun (Universiteit van Californië-Los Angeles, Farmacologie en Moleculaire Geneeskunde ) voor het verschaffen van bacteriële kunstmatige chromosoom van γHV68 voor deze studie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Speck, S. H., Ganem, D. Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses. Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).
- Dong, X. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).
- Strauss, W. M., Ausubel, F. M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).
- Song, M. J. Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).
- Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. Cloning of β-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).
- Sun, Q. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Kawai, T. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Meylan, E. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Xu, L. G. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
