В этой статье описаны основные процедуры проведения оптических экспериментов отображение в Langendorff-перфузии сердца кролика использованием панорамной системы визуализации, а также двойное (напряжение и кальция) изображения модальности.
Оптическое изображение и флуоресцентных зондов существенно передовые методологии исследования в области сердечной электрофизиологии способами, которые не могли быть выполнены другими приближается к 1. С помощью кальция и напряжения чувствительных красителей, оптические отображение позволяет измерять трансмембранных потенциалов действия и кальция переходные процессы с высоким пространственным разрешением без физического контакта с тканью. Это делает измерения электрической активности сердечной возможно при многих условиях, когда использование электродов неудобно или невозможно 1. Например, оптические записи предоставлять точную морфологические изменения мембранного потенциала во время и сразу после стимуляции и дефибрилляции, в то время как обычные методы электрода страдают от стимул-индуцированной артефакты во время и после стимулов из-за поляризации электродов 1.
Langendorff-перфузии сердца кролика является одним из наиболее изученных моделей человеческой физиологии и патофизиологии сердца. Многие виды аритмии наблюдались клинически могут быть обобщены в модели сердца кролика. Было показано, что волновые паттерны в сердца кролика при желудочковой аритмии, определяется эффективный размер сердца и длины волны спускаемого, очень похожи на том, что в человеческом сердце 2. Было также показано, что критические аспекты возбуждения-сжатия (ЕС) связи в миокарде кролика, такие как относительный вклад саркоплазматического ретикулума (СР), очень похожи на человеческие связи ЕС 3. Здесь мы приводим основные процедуры оптических экспериментов отображение в Langendorff-перфузии сердца кролика, в том числе системы Langendorff перфузии установки, оптические картографические системы установки, изоляции и катетеризации сердца, перфузии и красителя окрашивание сердца, возбуждение-сокращение расстыковки и сбор оптических сигналов. Эти методы могут быть также применены к сердцу от видов, кроме кролика с корректировкой расхода, оптика, растворов и др.
Два оптических систем отображения описаны. Панорамная система отображения используется для отображения всей эпикарда из сердца кролика 4-7. Эта система обеспечивает глобальный взгляд на эволюцию возвратных схем во время arrhythmogenesis и дефибрилляции, и был использован для изучения механизмов развития аритмий и antiarrhythmia терапии 8,9. Двойная система отображения используется для сопоставления потенциала действия (AP) и кальция переходных (КПП) одновременно с того же поля зрения 10-13. Такой подход расширил наше понимание важной роли кальция в электрических альтернации и индукции аритмии 14-16.
Основываясь на нашем опыте, ключи для успешной Langendorff-перфузии эксперимент сердце кролика включают хорошо подготовленный Tyrodes "решение, быстрый урожай сердце, ухоженные перфузионного давления, а также соответствующие рН кислородом раствора в перфузионной системе. Для записи сигнала с максимально возможной сигнал-шум, мы должны рассмотреть факторы, включая источник света, оптические фильтры, фокусирующей оптикой, фотоприемников и т.д. 19. Подробная информация об этих аспектах, обсуждаются в другом месте 19. Молодые кролики (возраст: 4-5 месяцев, вес: 7-9 фунтов) могут быть использованы, чтобы избежать эпикардиальных жира, что снижает отношение сигнал-шум в оптических сигналов.
Сигнал записан каждый пиксель представляет собой взвешенное интеграции излучаемого света от объема ткани. Глубина этой ткани объем зависит от возбуждения и излучения длиной волны красителя. Для ди-4-ANEPPS, как, например, оценкам глубина проникновения 300μm в сердца кролика 20. Таким образом, интерпретация оптического сигнала должно быть сделано с большой осторожностью, когда местные неоднородности электрических функции присутствуют в синусового узла, атриовентрикулярная узла, а во время желудочковой аритмии 1,21,22.
Одним из ограничений оптической техники отображение по сравнению с электродом записи является то, что фазы реполяризации оптического потенциала действия часто distored движением артефакт вызван сердечного сокращения. Механические ограничения могут быть использованы для уменьшения артефактов, но не может полностью устранить его. Для сравнения, фармакологические возбуждение-сокращение разобщители эффективны в удалении движения артефакт. Однако эти разобщители (например, 2,3-бутандион Monoxime) может иметь значительные электрофизиологических побочных эффектов. Blebbistatin был продемонстрирован иметь никаких негативных побочных эффектов на сердечно электрофизиологии в нормальное сердце 23, и, таким образом, перспективным разобщающий агент для оптического отображения. Следует отметить, что ускорение отеков, вызванных отменой сокращение может также повлиять на электрофизиологии.
The authors have nothing to disclose.
NIH гранты R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Reagent | Company | Catalogue Number |
NaCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S271-1 |
CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C79-500 |
KCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S217-500 |
MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | M33-500 |
NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S369-500 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S233-3 |
D-Glucose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | D16-1 |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | 1760 |
Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Carlsbad, CA | D1199 |
RH237 | Invitrogen, Carlsbad, CA | S1109 |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | R1244 |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA | P3000MP |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma, St. Louis, MO | D2650 |