Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling
Summary
Aproveitando os avanços na fluoróforo desenvolvimento e tecnologia de imagem, um método simples de Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue foi planejado para visualizar a interação precoce entre vírus e células.
Abstract
Os eventos iniciais na interação entre vírus e células podem ter profunda influência sobre o resultado da infecção. Determinar os fatores que influenciam essa interação pode levar a uma melhor compreensão da patogênese da doença e assim influenciar a vacina ou o projeto terapêutico. Assim, o desenvolvimento de métodos para investigar essa interação seria útil. Os recentes avanços na fluoróforos desenvolvimento 1-3 e tecnologia de imagem 4 pode ser explorada para melhorar o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da dengue e assim pavimentar o caminho para reduzir os milhões de infecções por dengue ocorrem anualmente.
O vírus da dengue envolvido tem um andaime externo composto de 90 glicoproteína do envelope (E) dímeros que protejam o reservatório nucleocapsídeo, que contém uma fita única de RNA positivo genoma 5. As subunidades idênticas de proteína na superfície do vírus pode assim ser rotulados com um corante reativo de amina e visualizados através de microscopia de imunofluorescência. Aqui, apresentamos um método simples de rotulagem do vírus da dengue com Alexa Fluor succinimidyl éster corante dissolvido diretamente em um buffer de bicarbonato de sódio que rendeu vírus altamente viável após rotulagem. Não existe um procedimento padronizado para a rotulagem de vírus vivo e protocolo do fabricante existente para a rotulagem de proteínas geralmente requer a reconstituição do corante em dimetilsulfóxido. A presença de dimetilsulfóxido, mesmo em quantidades mínimas, podem bloquear a infecção produtiva de vírus e também induzir citotoxicidade de 6 células. A exclusão do uso de dimetil sulfóxido neste protocolo, assim, reduzida essa possibilidade. Corantes Alexa Fluor têm fotoestabilidade superior e são menos sensíveis ao pH do que as tinturas comuns, como a fluoresceína e rodamina 2, tornando-as ideais para estudos sobre a absorção celular e transporte endossomal do vírus. A conjugação de Alexa Fluor tintura não afeta o reconhecimento do vírus da dengue rotulado por vírus específicos de anticorpos e seus supostos receptores em células hospedeiras 7. Esse método pode ter aplicações úteis em estudos virológicos.
Protocol
Discussion
Embora AF594 corante foi usado neste relatório, uma ampla gama de fluoróforos na succinimidyl Alexa Fluor ésteres série está disponível com a química rotulagem similar. Isso poderia estender a aplicação rotulagem além de imagens. Citometria de fluxo pode ser usado como uma alternativa para microscopia confocal para estimar o grau de rotulagem para os fluoróforos que pode ser animado e detectado pela máquina FACS.
Corantes Alexa Fluor são pequenas moléculas que reagem com grupos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Medical Research Council, de Cingapura.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
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