Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage
Summary
Profitant des avancées dans le développement de fluorophore et la technologie d'imagerie, une méthode simple de Alexa Fluor étiquetage des virus de la dengue a été conçu pour visualiser les interactions précoces entre le virus et la cellule.
Abstract
Les événements au début de l'interaction entre le virus et la cellule peut avoir une influence profonde sur l'issue de l'infection. Déterminer les facteurs qui influencent cette interaction pourrait conduire à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie et ainsi influencer la conception de vaccin ou thérapeutiques. Ainsi, le développement de méthodes pour sonder cette interaction pourrait être utile. Les récents progrès dans le développement des fluorophores 1-3 et la technologie d'imagerie 4 peut être exploitée pour améliorer nos connaissances actuelles sur la pathogénie de la dengue et d'ouvrir ainsi la voie pour réduire les millions de cas de dengue survenant chaque année.
Le virus de la dengue a enveloppé une externes échafaudage constitué de 90 glycoprotéine de l'enveloppe (E) dimères protégeant le réservoir nucléocapside, qui contient un seul brin ARN positif du génome 5. Les sous-unités protéiques identiques sur la surface du virus peuvent donc être étiquetés avec un colorant amine réactive et visualisées par microscopie d'immunofluorescence. Ici, nous présentons une méthode simple de l'étiquetage des virus de la dengue avec Alexa Fluor succinimidyl ester colorant dissous directement dans un tampon bicarbonate de sodium qui a produit virus hautement viable après l'étiquetage. Il n'ya pas de procédure standardisée pour l'étiquetage des virus vivants et le protocole du fabricant existants pour l'étiquetage des protéines nécessite généralement la reconstitution de la teinture dans le diméthylsulfoxyde. La présence de diméthylsulfoxyde, même en quantités infimes, peut bloquer l'infection productive des virus et aussi induire 6 cytotoxicité cellulaire. L'exclusion de l'utilisation de diméthylsulfoxyde dans ce protocole ainsi réduit cette possibilité. Alexa Fluor colorants ont photostabilité supérieure et sont moins sensibles au pH que les colorants communs, tels que la fluorescéine et la rhodamine 2, ce qui les rend idéales pour des études sur l'absorption cellulaire et le transport endosomal du virus. La conjugaison de Alexa Fluor colorant n'a pas d'incidence sur la reconnaissance du virus de la dengue labellisé par le virus de l'anticorps spécifique et de ses récepteurs putatifs en 7 cellules de l'hôte. Cette méthode pourrait avoir des applications utiles dans les études virologiques.
Protocol
Discussion
Bien AF594 colorant a été utilisé dans ce rapport, une large gamme de fluorophores dans la série Alexa Fluor esters succinimidyle est disponible avec la chimie étiquetage similaire. Cela pourrait étendre l'application de l'étiquetage au-delà de l'imagerie. La cytométrie en flux peut être utilisé comme une alternative à la microscopie confocale pour estimer le degré d'étiquetage pour les fluorophores qui peuvent être excités et détectés par la machine FACS.
A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le Conseil national de la recherche médicale, à Singapour.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
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