Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling
Summary
Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.
Abstract
Die frühen Ereignisse bei der Interaktion zwischen Virus und Zelle kann großen Einfluss auf das Ergebnis der Infektion haben. Ermittlung der Faktoren, die diese Interaktion beeinflussen könnten zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankung führen und damit Einfluss Impfstoff oder therapeutische Design. Daher wäre die Entwicklung von Methoden, um diese Wechselwirkung Sonde nützlich sein. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung Fluorophore 1-3 und Imaging-Technologie 4 kann ausgenutzt werden, um unserem derzeitigen Kenntnisstand auf Dengue Pathogenese zu verbessern und somit den Weg zu den Millionen von Dengue-Infektionen, die jährlich zu reduzieren.
Der umhüllte Dengue-Virus verfügt über eine externe Gerüst, bestehend aus 90 Hüllglycoprotein (E)-Dimere Schutz der Nukleokapsid Schale, die eine einzelne positive Strang-RNA-Genom 5 enthält. Die identische Protein-Untereinheiten auf der Virusoberfläche können somit mit einem Amin reaktiven Farbstoff markiert und visualisiert werden durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Hier präsentieren wir eine einfache Methode zur Kennzeichnung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor Succinimidylester Farbstoff direkt in einem Natriumbicarbonatpuffer, die sehr tragfähig Virus nach der Kennzeichnung ergab aufgelöst. Es gibt kein standardisiertes Verfahren für die Kennzeichnung von lebenden Virus und bestehenden Protokoll des Herstellers für Protein-Kennzeichnung erfordert in der Regel die Wiederherstellung der Farbstoff in Dimethylsulfoxid. Die Anwesenheit von Dimethylsulfoxid, selbst in kleinsten Mengen, blockieren kann produktive Infektion von Viren und induzieren auch Zell-Zytotoxizität 6. Der Ausschluss von der Verwendung von Dimethylsulfoxid in diesem Protokoll somit reduziert diese Möglichkeit. Alexa Fluor Farbstoffe überlegen Photostabilität und sind weniger pH-empfindlicher als die gemeinsame Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin 2, wodurch sie ideal für Studien zur zellulären Aufnahme und endosomalen Transport des Virus. Die Konjugation von Alexa Fluor Farbstoff keinen Einfluss auf die Anerkennung der Bezeichnung Dengue-Virus durch Virus-spezifische Antikörper und ihre vermeintliche Rezeptoren in Host-Zellen 7. Diese Methode könnte nützliche Anwendungen in der virologischen Untersuchungen.
Protocol
Discussion
Obwohl AF594 Farbstoff in diesem Bericht verwendet wurde, ist eine breite Palette von Fluorophoren in der Alexa Fluor Succinimidylestern Serie mit ähnlichen Kennzeichnung Chemie. Dies könnte zu verlängern die Kennzeichnung Anwendung über Bildgebung. Die Durchflusszytometrie kann als Alternative zur konfokalen Mikroskopie für die Einschätzung des Grades der Kennzeichnung für Fluorophore, die angeregt und detektiert werden durch die FACS-Maschine verwendet werden kann.
Alexa Fluor-Farbs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Medical Research Council, Singapore finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- . . Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
