एलेक्सा Fluor लेबल के माध्यम से डेंगू वायरस Visualizing
Summary
Fluorophore विकास और इमेजिंग तकनीक, Alexa Fluor लेबलिंग डेंगू के वायरस वायरस और सेल के बीच बातचीत जल्दी कल्पना करने के लिए तैयार किया गया था की एक सरल विधि के क्षेत्र में प्रगति का लाभ उठाते हुए.
Abstract
वायरस और सेल के बीच बातचीत में जल्दी घटनाओं संक्रमण के परिणाम पर गहरा प्रभाव हो सकता है. निर्धारण कारक है कि इस बातचीत को प्रभावित रोग रोगजनन की बेहतर समझ के लिए नेतृत्व और इस तरह से टीका या चिकित्सीय डिजाइन को प्रभावित कर सकता है. इसलिए, विधियों के विकास के लिए इस बातचीत की जांच उपयोगी होगा. Fluorophores विकास 1-3 और इमेजिंग प्रौद्योगिकी 4 में हाल ही में प्रगति डेंगू रोगजनन पर हमारे वर्तमान ज्ञान में सुधार और इस प्रकार सालाना घटनेवाला डेंगू संक्रमण के लाखों को कम करने के लिए मार्ग प्रशस्त करने के लिए शोषण किया जा सकता है.
छा डेंगू वायरस के लिए एक बाहरी पाड़ 90 लिफाफा glycoprotein (ई) nucleocapsid खोल, जो एक सकारात्मक भूग्रस्त आरएनए जीनोम 5 शामिल रक्षा dimers से मिलकर की है. वायरस की सतह पर समान प्रोटीन सब यूनिटों को इस तरह से एक amine प्रतिक्रियाशील डाई के साथ लेबल किया जा सकता है और immunofluorescent माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना. यहाँ, हम Alexa Fluor succinimidyl एस्टर डाई सोडियम बिकारबोनिट बफर है कि लेबलिंग के बाद अत्यधिक व्यवहार्य वायरस झुकेंगे में सीधे भंग के साथ डेंगू वायरस की लेबलिंग का एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं. जीवित वायरस और मौजूदा निर्माता प्रोटोकॉल के लिए प्रोटीन लेबलिंग आमतौर पर डाइमिथाइल sulfoxide में डाई के पुनर्गठन की आवश्यकता है की लेबलिंग के लिए कोई मानकीकृत प्रक्रिया है. डाइमिथाइल sulfoxide की उपस्थिति भी मिनट मात्रा में, इस वायरस के उत्पादक संक्रमण ब्लॉक और भी सेल cytotoxicity 6 प्रेरित कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में डाइमिथाइल sulfoxide के उपयोग के अपवर्जन इस प्रकार इस संभावना को कम. एलेक्सा Fluor रंजक बेहतर photostability है और fluorescein और rhodamine 2 के रूप में आम रंजक, की तुलना में कम पीएच के प्रति संवेदनशील हैं, उन्हें सेलुलर तेज और वायरस के endosomal परिवहन पर अध्ययन के लिए आदर्श बना. Alexa Fluor डाई के संयुग्मन लेबल डेंगू वायरस के वायरस विशेष एंटीबॉडी और मेजबान 7 कोशिकाओं में अपने ख्यात रिसेप्टर्स द्वारा मान्यता को प्रभावित नहीं किया. इस विधि virological अध्ययन में उपयोगी अनुप्रयोगों सकता है.
Protocol
Discussion
हालांकि इस रिपोर्ट में AF594 डाई इस्तेमाल किया गया था, इसी तरह की लेबलिंग रसायन शास्त्र के साथ Alexa Fluor succinimidyl एस्टर श्रृंखला में fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है. यह इमेजिंग परे लेबलिंग आवेदन का विस्तार क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद, सिंगापुर द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
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