Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado
Summary
Aprovechando los avances en el desarrollo de fluoróforo y la tecnología de imágenes, un método sencillo de Alexa Fluor etiquetado de los virus del dengue se ideó para visualizar las primeras interacciones entre el virus y la célula.
Abstract
Los primeros eventos en la interacción entre el virus y la célula puede tener gran influencia en el resultado de la infección. Determinación de los factores que influyen en esta interacción podría conducir a una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad y así influir en el diseño de vacunas o terapéuticos. Por lo tanto, el desarrollo de métodos para investigar esta interacción sería útil. Los recientes avances en el desarrollo de fluoróforos 1-3 y tecnología de imagen 4 puede ser aprovechado para mejorar nuestros conocimientos actuales sobre la patogénesis del dengue y así allanar el camino para reducir los millones de infecciones de dengue ocurren anualmente.
El virus del dengue tiene una envoltura externa andamio que consta de 90 sobre glicoproteína (E) dímeros que protejan el depósito nucleocápside, que contiene una sola hebra de ARN del genoma positivo 5. Las subunidades proteicas idénticas en la superficie del virus por lo tanto pueden ser etiquetados con un colorante reactivo de amina y se visualizan a través de microscopía de inmunofluorescencia. A continuación, presentamos un método simple de etiquetado de los virus del dengue con Alexa Fluor succinimidil éster tinte disuelve directamente en un buffer de bicarbonato de sodio que se produjo el virus altamente viable después del marcaje. No existe un procedimiento normalizado para el etiquetado de los virus vivos y el protocolo existente de un fabricante para el etiquetado de proteínas por lo general requiere la reconstitución de un colorante en dimetilsulfóxido. La presencia de dimetilsulfóxido, incluso en cantidades mínimas, puede bloquear la infección del virus de la producción y también inducir la citotoxicidad celular 6. La exclusión del uso de dimetilsulfóxido en este protocolo lo que reduce esta posibilidad. Alexa Fluor tiene tintes fotoestabilidad superior y son menos sensibles al pH que los tintes comunes, como la fluoresceína y rodamina 2, lo que es ideal para el estudio de la captación celular y el transporte endosomal del virus. La conjugación de Alexa Fluor tinte no afecta el reconocimiento de virus del dengue etiquetados por el virus de anticuerpos específicos y sus supuestos receptores de siete células del huésped. Este método podría tener aplicaciones útiles en los estudios virológicos.
Protocol
Discussion
Aunque AF594 colorante se utilizó en este informe, una amplia gama de fluoróforos en la serie Alexa Fluor ésteres succinimidilo está disponible con la química de etiquetado similar. Esto podría extender la aplicación de etiquetado más allá de la imagen. La citometría de flujo se puede utilizar como una alternativa a la microscopía confocal para estimar el grado de etiquetado para los fluoróforos que puede ser excitado y detectado por la máquina de FACS.
Alexa Fluor colorantes so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido financiado por la National Medical Research Council, Singapur.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- . . Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
