Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling
Summary
Dra nytta av de framsteg i fluoroforen utveckling och bildteknik, en enkel metod för Alexa Fluor märkning av denguefeber virus utformades för att visualisera det tidiga samspelet mellan virus och cell.
Abstract
Den tidiga händelser i samspelet mellan virus och cell kan ha stor påverkan på resultatet av infektion. Att fastställa de faktorer som påverkar denna interaktion kan leda till ökad förståelse för sjukdomen patogenes och därmed påverka vaccin eller terapeutiska design. Därför skulle utvecklingen av metoder för att undersöka detta samspel vara användbart. Senaste framstegen inom fluoroforer utveckling 1-3 och bildteknik 4 kan utnyttjas för att förbättra vår nuvarande kunskap om denguefeber patogenes och därmed bana väg för att minska de miljontals denguefeber infektioner inträffar årligen.
Den höljeförsedda denguefeber viruset har en extern schavotten bestående av 90 (E) kuvert glykoprotein dimerer skydda nukleokapsid skal, som innehåller ett enda positivt tråd RNA-genom 5. Den identiska protein subenheter på viruset ytan kan därmed märkas med en amin reaktiva färg-och visualiseras genom immunofluorescens mikroskopi. Här presenterar vi en enkel metod för märkning av denguefeber virus med Alexa Fluor succinimidyl ester färgen löses upp direkt i en bikarbonat buffert som gav mycket livskraftiga virus efter märkning. Det finns inget standardiserat förfarande för märkning av levande virus och befintliga tillverkarens protokoll för protein märkning krävs i allmänhet beredning av färg i dimetylsulfoxid. Förekomsten av dimetylsulfoxid, även i små mängder, kan blockera produktiv infektion av viruset och förmå cell cytotoxicitet 6. Undantaget för användning av dimetylsulfoxid i detta protokoll minskas alltså denna möjlighet. Alexa Fluor färgämnen har en överlägsen fotostabilitet och är mindre pH-känslig än vanliga färger, såsom fluorescein och Rhodamine 2, vilket gör dem idealiska för studier av cellulära upptag och endosomal transport av viruset. Den konjugering av Alexa Fluor färgämnet påverkade inte erkänna märkt denguefeber virus av virus-specifik antikropp och dess förmodade receptorer i värdceller 7. Denna metod kunde ha användbara program i virologiska studier.
Protocol
Discussion
Även AF594 färg har använts i denna rapport är ett brett spektrum av fluoroforer i Alexa Fluor succinimidyl estrar serie nu med liknande märkning kemi. Detta kan förlänga märkning ansökan bortom avbildning. Flödescytometri kan användas som ett alternativ till konfokalmikroskopi för att uppskatta graden av märkning för fluoroforer som kan vara upphetsad och upptäcks av FACS maskin.
Alexa Fluor färgämnen är små molekyler som reagerar med fria aminogrupper, främst arginin oc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av National Medical Research Council, Singapore.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- . . Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
