تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Summary

هنا ، نحن تصف وضع بروتوكول لتنقية نشطة للغاية Hsp104 ، وهو AAA + hexameric البروتين من الخميرة ، والتي المائي ATP الأزواج على تصنيفها البروتين. هذا المخطط يستغل بناء His6 الموسومة لتنقية تقارب من<em> E. القولونية</em> تليها أنيون تبادل اللوني ، His6 ، مع إزالة علامة TEV البروتيني ، واللوني الحجم الاستبعاد.

Abstract

Hsp104 هو hexameric AAA + البروتين ¹ من الخميرة ، والتي المائي ATP الأزواج على تصنيفها بروتين ^20-10 (الشكل 1). يضفي هذا النشاط الانتقائي ميزتان الرئيسية. أولا ، استعادة الطبيعة من المجاميع التي المختلين Hsp104 يخول بقاء الخميرة بعد تشدد البروتين misfolding المختلفة ، بما في ذلك الصدمة الحرارية ^{3،5،11،12.} ثانيا ، إعادة تشكيل الألياف اميلويد بيتا عبر Hsp104 التي تمكن من استغلال الخميرة البريونات لا تعد ولا تحصى (amyloids المعدية) كمستودع للفائدة وراثية الاختلاف المظهري ^13-22. بشكل ملحوظ ، ويعيد تشكيل Hsp104 مباشرة oligomers preamyloid والألياف اميلويد ، بما فيها تلك التي تتكون من بروتينات بريون الخميرة وSup35 Ure2 ^23-30. هذه الوظيفة اميلويد هو إعادة تشكيل الوجه المتخصصة Hsp104 الخميرة. وهاء orthologue القولونية ، ClpB ، فشل أو يعيد oligomers preamyloid ييفات اميلويد ^26،31،32.

تم العثور على orthologues Hsp104 في جميع ممالك الحياة باستثناء perplexingly والحيوانات. في الواقع ، ما إذا كانت الخلايا الحيوانية تمتلك أي نظام الأنزيمية أن الأزواج تصنيفها البروتين لاستعادة الطبيعة (بدلا من التدهور) لا يزال غير معروف ^33-35. وبالتالي ، اقترحنا وغيرها التي يمكن وضعها Hsp104 كعامل العلاجية لمختلف الأمراض العصبية مرتبطة misfolding من بروتينات معينة في oligomers preamyloid السامة والألياف اميلويد ^{4،7،23،36-38.} لا توجد علاجات التي تستهدف بشكل مباشر الأنواع المجمعة المرتبطة بهذه الأمراض. حتى الآن ، ويذوب Hsp104 oligomers السامة ويتألف من الألياف اميلويد synuclein ألفا ، والتي ترتبط مع مرض باركنسون ²³ فضلا عن أشكال من الأميلويد بي ار بي ^39. الأهم من ذلك ، يقلل Hsp104 تجميع البروتين وإلى التقليل من تنكس عصبي في نماذج من القوارض مرض باركنسون ²³ و ³⁸ مرض هنتنغتون. من الناحية المثالية ، لتحسين العلاج والتقليل من الآثار الجانبية ، ستكون هندستها وHsp104 potentiated لإعادة انتقائي المجاميع الخاصة المركزية لهذا المرض في السؤال ^4،7. ومع ذلك ، فإن الفهم المحدود الهيكلية والميكانيكية لليقسم Hsp104 كيف يمكن لمثل ذخيرة متنوعة من هياكل مجمعة والبروتينات لا علاقة لها يحبط هذه المساعي ^30،40-42.

لفهم بنية وآلية Hsp104 ، فإنه لا بد من دراسة هذا البروتين النقي وإعادة نشاطها disaggregase بمكونات ضئيلة. Hsp104 هو بروتين 102kDa مع الباياء من ~ 5.3 ، الذي hexamerizes في وجود أو ADP ATP ، أو على تركيزات عالية من البروتين في غياب ^43-46 النوكليوتيدات. هنا ، نحن تصف بروتوكول الأمثل لتنقية Hsp104 ، نشطة للغاية مستقرة من E. القولونية. استخدام E. القولونية يسمح مبسطة على نطاق واسع الإنتاج ويمكن أن يؤديها لدينا وسيلة سريعة وموثوق بها عن المتغيرات Hsp104 عديدة. بروتوكول لدينا زيادات Hsp104 النقاء ويبسط له ₆ – إزالة علامة مقارنة طريقة تنقية السابقة من E. ⁴⁷ القولونية. وعلاوة على ذلك ، والبروتوكول لدينا أكثر من سهلة ومريحة بروتوكولين أكثر حداثة ^26،48.

Protocol

1. التعبير عن Hsp104 وتستخدم لتنقية البلازميد في E. القولونية ، pPROEX – HTB – Hsp104 ، يحتوي على Hsp104 مفتوح القراءة الإطار تحت سيطرة محرض لجنة الحقيقة والمصالحة المروج 26. وتنتج Hsp104 البلازميد مع N – محطة صاحب العلامة – <…

Discussion

الجدول الزمني : بالنسبة للنشاط Hsp104 القصوى من المستحسن أن يتم الانتهاء من خطة لتنقية كامل في أسرع وقت ممكن. ومع ذلك ، فإن عددا من الخطوات لتنقية جدول زمني يجعل المطالبة التي قد لا تكون دائما عملية. إذا نفذت الخطوات تنقية في أسرع وقت ممكن ، والوقت من نهاية التعبير من ?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT broth	USB	75864
Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets	Roche	1836170
Pepstatin A	Sigma	P4265
Ni-Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000)	Millipore	UFC903008
Resource Q – 6ml column	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV Protease	Promega	V6052
AcTEV Protease	Invitrogen	12575015
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Assay Designs	SPP-400
Hsp72	Assay Designs	ADI-NSP-555