Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase
Summary
We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering uit<em> E. coli</em> Gevolgd door anion-uitwisseling chromatografie, His6-tag verwijderen met TEV protease, en de grootte-uitsluiting chromatografie.
Abstract
Hsp104 is een hexamere AAA + eiwit 1 van gist, die koppels ATP hydrolyse aan proteïne disaggregatie 20-10 (afb. 1). Deze activiteit verleent twee belangrijke selectieve voordelen. De eerste, renaturatie van wanordelijke aggregaten door Hsp104 staat stelt gist overleving na diverse eiwit-misfolding benadrukt, met inbegrip van warmte shock 3,5,11,12. Ten tweede, remodeling van de cross-beta-amyloïde fibrillen door Hsp104 maakt gist naar talloze prionen (besmettelijke amyloids) als een reservoir van nuttige exploiteren en fenotypische variatie erfelijk 13-22. Opmerkelijk, Hsp104 renovaties direct preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen, waaronder die welke deel uitmaken van de gist prioneiwitten Sup35 en Ure2 23-30. Dit amyloid-remodeling-functionaliteit is een gespecialiseerde facet van gist Hsp104. De E. coli ortholoog, ClpB, niet verbouwen preamyloid oligomeren of amyloid fibrillen 26,31,32.
Hsp104 orthologen zijn te vinden in alle koninkrijken van het leven, behalve, perplexingly, dieren. Inderdaad, of dierlijke cellen een enzymatische systeem bezitten dat paren eiwit uitsplitsing naar renaturatie (in plaats van degradatie) blijft onbekend 33-35. Zo hebben wij en anderen stelden dat Hsp104 zou kunnen worden ontwikkeld als een therapeutisch middel voor verschillende neurodegeneratieve ziekten die verband houden met de misfolding van specifieke eiwitten in giftige preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen 4,7,23,36-38. Er zijn geen behandelingen die direct gericht zijn op de geaggregeerde soorten geassocieerd met deze ziekten. Toch Hsp104 lost giftige oligomeren en amyloïd fibrillen samengesteld uit alfa-synucleïne, die verbonden zijn met de ziekte van Parkinson 23 evenals amyloïd vormen van PrP 39. Belangrijk is dat Hsp104 vermindert de aggregatie van eiwitten en verbetert neurodegeneratie in knaagdiermodellen van de ziekte van Parkinson 23 en de ziekte van Huntington 38. In het ideale geval de therapie te optimaliseren en het minimaliseren van bijwerkingen, zou Hsp104 worden ontworpen en versterkt om selectief verbouwen specifieke aggregaten centraal in de ziekte in kwestie 4,7. Echter, de beperkte structurele en mechanistische begrip van hoe Hsp104 disaggregates zo'n divers repertoire van geaggregeerde structuren en ongerelateerde proteïnen frustreert deze inspanningen 30,40-42.
Het begrijpen van de structuur en het mechanisme van Hsp104, is het essentieel om de pure proteïne en herstellen zijn disaggregase activiteit studie met een minimum aan componenten. Hsp104 is een 102kDa eiwit met een pi van ~ 5.3, die hexamerizes in aanwezigheid van ADP-of ATP, of bij hoge concentraties eiwitten in de afwezigheid van nucleotide 43-46. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol voor de zuivering van zeer actieve, stabiele Hsp104 van E. coli. Het gebruik van E. coli maakt vereenvoudigde productie op grote schaal en onze methode kan snel en betrouwbaar worden uitgevoerd voor tal van Hsp104 varianten. Ons protocol verhoogt Hsp104 zuiverheid en vereenvoudigt Zijn 6-tag verwijderen vergelijking met een eerdere zuiveringsmethode van E. coli 47. Bovendien is ons protocol is gemakkelijk en handig dan twee meer recente protocollen 26,48.
Protocol
Discussion
Tijdlijn: Voor maximale Hsp104 activiteit raden wij aan dat de hele zuivering regeling zo snel worden afgerond mogelijk te maken. Echter, het aantal van zuivering stappen maakt een veeleisende schema dat niet altijd praktisch. Als de zuivering stappen worden uitgevoerd zo snel mogelijk, de tijd tussen het einde van de nacht uitdrukking tot en met de 2-4 uur incubatie bij 30 ° C met TEV protease is ongeveer 9-11 uur. Een mogelijke plek om te pauzeren is naar aanleiding van de TEV decollete stap. Indien absoluut n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (5T32GM008275-22) en een American Heart Association predoctorale gemeenschap (naar EAS), een scheikunde-biologie Interface Fellowship van de NIH (2T32GM071339-06A1) (tot MED), en subsidies van de NIH (1DP2OD002177-01 en NS067354-0110), De Ellison Medical Foundation en de Bill and Melinda Gates Foundation (naar JS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 |
| 2XYT broth | USB | 75864 |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 1836170 |
| Pepstatin A | Sigma | P4265 |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 |
| Resource Q – 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 |
| proTEV Protease | Promega | V6052 |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
References
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System that Rescues Previously Aggregated Proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88, 1-13 (2010).
- Parsell, D. A., Sanchez, Y., Stitzel, J. D., Lindquist, S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites. Nature. 353, 270-273 (1991).
- Doyle, S. M., Wickner, S. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci. 34, 40-48 (2009).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16, 63-74 (2008).
- Glover, J. R., Lum, R. Remodeling of protein aggregates by Hsp104. Protein Pept Lett. 16, 587-597 (2009).
- Mogk, A., Haslberger, T., Tessarz, P., Bukau, B. Common and specific mechanisms of AAA+ proteins involved in protein quality control. Biochem Soc Trans. 36, 120-125 (2008).
- Grimminger-Marquardt, V., Lashuel, H. A. Structure and function of the molecular chaperone Hsp104 from yeast. Biopolymers. 93, 252-276 (2010).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248, 1112-1115 (1990).
- Sanchez, Y., Taulien, J., Borkovich, K. A., Lindquist, S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress. Embo J. 11, 2357-2364 (1992).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137, 146-158 (2009).
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20, 125-1233 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6, 435-450 (2005).
- True, H. L., Berlin, I., Lindquist, S. L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature. 431, 184-187 (2004).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407, 477-483 (2000).
- Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, e294-e294 (2008).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268, 880-884 (1995).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science. 330, 629-632 (2010).
- Satpute-Krishnan, P., Langseth, S. X., Serio, T. R. Hsp104-dependent remodeling of prion complexes mediates protein-only inheritance. PLoS Biol. 5, e24-e24 (2007).
- Sweeny, E. A., Shorter, J. Prion proteostasis: Hsp104 meets its supporting cast. Prion. 2, 135-140 (2008).
- Lo Bianco, C. Hsp104 antagonizes alpha-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 118, 3087-3097 (2008).
- Narayanan, S., Walter, S., Reif, B. Yeast prion-protein, sup35, fibril formation proceeds by addition and substraction of oligomers. Chembiochem. 7, 757-765 (2006).
- Savistchenko, J., Krzewska, J., Fay, N., Melki, R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Ure2p in vitro. J Biol Chem. 283, 15732-15739 (2008).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304, 1793-1797 (2004).
- Shorter, J., Lindquist, S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hsp104 remodeling activities. Mol Cell. 23, 425-438 (2006).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40 interplay regulates formation, growth and elimination of Sup35 prions. Embo J. 27, 2712-2724 (2008).
- Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat Struct Mol Biol. 14, 114-122 (2007).
- Wendler, P. Atypical AAA+ subunit packing creates an expanded cavity for disaggregation by the protein-remodeling factor Hsp104. Cell. 131, 1366-1377 (2007).
- Hinault, M. P. Stable alpha-synuclein oligomers strongly inhibit chaperone activity of the Hsp70 system by weak interactions with J-domain co-chaperones. J Biol Chem. 285, 38173-38182 (2010).
- Tipton, K. A., Verges, K. J., Weissman, J. S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sis1 in delivering substrates to Hsp104. Mol Cell. 32, 584-591 (2008).
- Bieschke, J., Cohen, E., Murray, A., Dillin, A., Kelly, J. W. A kinetic assessment of the C. elegans amyloid disaggregation activity enables uncoupling of disassembly and proteolysis. Protein Sci1. 8, 2231-2241 (2009).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313, 1604-1610 (2006).
- Cohen, E. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
- Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 23, 1191-11201 (2010).
- Carmichael, J. Bacterial and yeast chaperones reduce both aggregate formation and cell death in mammalian cell models of Huntington’s disease. Proc Natl Acad Sci. 97, 9701-9705 (2000).
- Vacher, C., Garcia-Oroz, L., Rubinsztein, D. C. Overexpression of yeast hsp104 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington’s disease. Hum Mol Genet. 14, 3425-3433 (2005).
- Liu, Y. H. Heat Shock Protein 104 Inhibited the Fibrillization of Prion Peptide 106-126 and Disassembled Prion peptide 106-126 Fibrils in vitro. Int J Biochem Cell Biol. , (2011).
- Wendler, P., Saibil, H. R. Cryo electron microscopy structures of Hsp100 proteins: crowbars in or out. Biochem Cell Biol. 88, 89-96 (2010).
- Wendler, P. Motor mechanism for protein threading through Hsp104. Mol Cell. 34, 81-92 (2009).
- Lee, S., Sielaff, B., Lee, J., Tsai, F. T. CryoEM structure of Hsp104 and its mechanistic implication for protein disaggregation. Proc Natl Acad Sci. 107, 8135-8140 (2010).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Lindquist, S. Saccharomyces cerevisiae Hsp104 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 269, 4480-4487 (1994).
- Schirmer, E. C., Queitsch, C., Kowal, A. S., Parsell, D. A., Lindquist, S. The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J Biol Chem. 273, 15546-15552 (1998).
- Schirmer, E. C., Ware, D. M., Queitsch, C., Kowal, A. S., Lindquist, S. L. Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc Natl Acad Sci. 98, 914-919 (2001).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 (2002).
- Schirmer, E. C., Lindquist, S. Purification and properties of Hsp104 from yeast. Methods Enzymol. 290, 430-444 (1998).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hsp104 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc Natl Acad Sci. 99, 2732-2737 (2002).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J Biol Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Lum, R., Tkach, J. M., Vierling, E., Glover, J. R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104. J Biol Chem. 279, 29139-29146 (2004).
- Tessarz, P., Mogk, A., Bukau, B. Substrate threading through the central pore of the Hsp104 chaperone as a common mechanism for protein disaggregation and prion propagation. Mol Microbiol. 68, 87-97 (2008).
- Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell. 119, 653-665 (2004).
