Summary
Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de afinidade<em> E. coli</em> Seguido de cromatografia de troca aniônica, His6 tag-remoção com protease TEV e tamanho-exclusão cromatografia.
Abstract
Hsp104 é um hexamérica AAA + 1 proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP para a proteína desagregação 10/02 (Fig. 1). Esta atividade dá dois principais vantagens seletivas. Primeiro, renaturalização de agregados desordenada por Hsp104 capacita sobrevivência levedura após várias proteínas-misfolding salienta, incluindo choque térmico 3,5,11,12. Em segundo lugar, a remodelação das fibrilas de cross-beta-amilóide por Hsp104 permite levedura para explorar prions miríade (amilóides infecciosas) como um reservatório de benéfico e hereditárias variação fenotípica 13-22. Notavelmente, Hsp104 diretamente remodela oligômeros preamyloid e fibrilas amilóides, incluindo aqueles composto de proteínas de levedura prion Sup35 e Ure2 23-30. Esta funcionalidade amilóide remodelação é uma faceta especializados de levedura Hsp104. O E. orthologue coli, ClpB, não oligômeros remodelar preamyloid ou fibrilas amilóides 26,31,32.
Orthologues Hsp104 são encontrados em todos os reinos da vida, exceto, perplexidade, os animais. De fato, se as células animais possuem qualquer sistema enzimático que os casais desagregação proteína para renaturalização (ao invés de degradação) permanece desconhecido 33-35. Assim, nós e outros propuseram que Hsp104 pode ser desenvolvido como um agente terapêutico para várias doenças neurodegenerativas relacionadas com o misfolding de proteínas específicas em oligômeros preamyloid tóxicos e fibrilas amilóides 4,7,23,36-38. Não existem tratamentos que visam directamente as espécies agregados associados a estas doenças. No entanto, se dissolve Hsp104 oligômeros tóxicos e fibrilas amilóides composto de alfa-sinucleína, que são conectados com Doença de Parkinson 23, bem como formas de amilóide de PrP 39. Importante, Hsp104 reduz a agregação da proteína e melhora a neurodegeneração em modelos de roedores da doença de Parkinson 23 e doença de Huntington 38. Idealmente, para otimizar o tratamento e minimizar os efeitos colaterais, Hsp104 seria projetado e potencializadas para seletivamente remodelar agregados específicos central para a doença em questão 4,7. No entanto, a limitada compreensão estrutural e mecânica de como Hsp104 desagrega um repertório tão diversificado de estruturas agregadas e proteínas não relacionadas frustra estes esforços 30,40-42.
Para compreender a estrutura e mecanismo de Hsp104, é essencial para estudar a proteína pura e reconstituir a sua actividade disaggregase com componentes mínimos. Hsp104 é uma proteína 102kDa com um pI de aproximadamente 5,3, que hexamerizes na presença de ADP ou ATP, ou em concentrações da proteína na ausência de 43-46 nucleotídeos. Aqui, nós descrevemos um protocolo otimizado para a purificação de altamente ativa, Hsp104 estável de E. coli. O uso de E. coli simplificado permite produção em larga escala e nosso método pode ser realizado de forma rápida e confiável para inúmeras Hsp104 variantes. Nosso protocolo aumenta Hsp104 pureza e simplifica a sua remoção 6 tag em comparação com um método de purificação prévia do E. coli 47. Além disso, o nosso protocolo é mais fácil e conveniente do que dois protocolos mais recentes 26,48.
Protocol
Discussion
Cronograma: Para a atividade Hsp104 máxima recomendamos que o sistema de purificação de todo ser concluída o mais rapidamente possível. No entanto, o número de etapas de purificação torna um calendário exigente, que nem sempre pode ser prático. Se as etapas de purificação são realizadas o mais rapidamente possível, o tempo a partir do final de expressão durante a noite até a 2-4 horas de incubação a 30 ° C com TEV protease é de aproximadamente 9-11 horas. Um lugar potencial para fazer uma paus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma concessão do NIH (5T32GM008275-22) e um American Heart Association predoctoral comunhão (para EAS); uma bolsa de interface Química Biologia a partir do NIH (2T32GM071339-06A1) (para MED); e subvenções do NIH (1DP2OD002177-01 e NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation e The Bill and Melinda Gates Foundation (a JS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 |
| 2XYT broth | USB | 75864 |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 1836170 |
| Pepstatin A | Sigma | P4265 |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 |
| Resource Q – 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 |
| proTEV Protease | Promega | V6052 |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
References
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System that Rescues Previously Aggregated Proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88, 1-13 (2010).
- Parsell, D. A., Sanchez, Y., Stitzel, J. D., Lindquist, S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites. Nature. 353, 270-273 (1991).
- Doyle, S. M., Wickner, S. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci. 34, 40-48 (2009).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16, 63-74 (2008).
- Glover, J. R., Lum, R. Remodeling of protein aggregates by Hsp104. Protein Pept Lett. 16, 587-597 (2009).
- Mogk, A., Haslberger, T., Tessarz, P., Bukau, B. Common and specific mechanisms of AAA+ proteins involved in protein quality control. Biochem Soc Trans. 36, 120-125 (2008).
- Grimminger-Marquardt, V., Lashuel, H. A. Structure and function of the molecular chaperone Hsp104 from yeast. Biopolymers. 93, 252-276 (2010).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248, 1112-1115 (1990).
- Sanchez, Y., Taulien, J., Borkovich, K. A., Lindquist, S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress. Embo J. 11, 2357-2364 (1992).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137, 146-158 (2009).
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20, 125-1233 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6, 435-450 (2005).
- True, H. L., Berlin, I., Lindquist, S. L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature. 431, 184-187 (2004).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407, 477-483 (2000).
- Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, e294-e294 (2008).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268, 880-884 (1995).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science. 330, 629-632 (2010).
- Satpute-Krishnan, P., Langseth, S. X., Serio, T. R. Hsp104-dependent remodeling of prion complexes mediates protein-only inheritance. PLoS Biol. 5, e24-e24 (2007).
- Sweeny, E. A., Shorter, J. Prion proteostasis: Hsp104 meets its supporting cast. Prion. 2, 135-140 (2008).
- Lo Bianco, C. Hsp104 antagonizes alpha-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 118, 3087-3097 (2008).
- Narayanan, S., Walter, S., Reif, B. Yeast prion-protein, sup35, fibril formation proceeds by addition and substraction of oligomers. Chembiochem. 7, 757-765 (2006).
- Savistchenko, J., Krzewska, J., Fay, N., Melki, R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Ure2p in vitro. J Biol Chem. 283, 15732-15739 (2008).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304, 1793-1797 (2004).
- Shorter, J., Lindquist, S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hsp104 remodeling activities. Mol Cell. 23, 425-438 (2006).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40 interplay regulates formation, growth and elimination of Sup35 prions. Embo J. 27, 2712-2724 (2008).
- Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat Struct Mol Biol. 14, 114-122 (2007).
- Wendler, P. Atypical AAA+ subunit packing creates an expanded cavity for disaggregation by the protein-remodeling factor Hsp104. Cell. 131, 1366-1377 (2007).
- Hinault, M. P. Stable alpha-synuclein oligomers strongly inhibit chaperone activity of the Hsp70 system by weak interactions with J-domain co-chaperones. J Biol Chem. 285, 38173-38182 (2010).
- Tipton, K. A., Verges, K. J., Weissman, J. S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sis1 in delivering substrates to Hsp104. Mol Cell. 32, 584-591 (2008).
- Bieschke, J., Cohen, E., Murray, A., Dillin, A., Kelly, J. W. A kinetic assessment of the C. elegans amyloid disaggregation activity enables uncoupling of disassembly and proteolysis. Protein Sci1. 8, 2231-2241 (2009).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313, 1604-1610 (2006).
- Cohen, E. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
- Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 23, 1191-11201 (2010).
- Carmichael, J. Bacterial and yeast chaperones reduce both aggregate formation and cell death in mammalian cell models of Huntington’s disease. Proc Natl Acad Sci. 97, 9701-9705 (2000).
- Vacher, C., Garcia-Oroz, L., Rubinsztein, D. C. Overexpression of yeast hsp104 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington’s disease. Hum Mol Genet. 14, 3425-3433 (2005).
- Liu, Y. H. Heat Shock Protein 104 Inhibited the Fibrillization of Prion Peptide 106-126 and Disassembled Prion peptide 106-126 Fibrils in vitro. Int J Biochem Cell Biol. , (2011).
- Wendler, P., Saibil, H. R. Cryo electron microscopy structures of Hsp100 proteins: crowbars in or out. Biochem Cell Biol. 88, 89-96 (2010).
- Wendler, P. Motor mechanism for protein threading through Hsp104. Mol Cell. 34, 81-92 (2009).
- Lee, S., Sielaff, B., Lee, J., Tsai, F. T. CryoEM structure of Hsp104 and its mechanistic implication for protein disaggregation. Proc Natl Acad Sci. 107, 8135-8140 (2010).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Lindquist, S. Saccharomyces cerevisiae Hsp104 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 269, 4480-4487 (1994).
- Schirmer, E. C., Queitsch, C., Kowal, A. S., Parsell, D. A., Lindquist, S. The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J Biol Chem. 273, 15546-15552 (1998).
- Schirmer, E. C., Ware, D. M., Queitsch, C., Kowal, A. S., Lindquist, S. L. Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc Natl Acad Sci. 98, 914-919 (2001).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 (2002).
- Schirmer, E. C., Lindquist, S. Purification and properties of Hsp104 from yeast. Methods Enzymol. 290, 430-444 (1998).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hsp104 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc Natl Acad Sci. 99, 2732-2737 (2002).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J Biol Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Lum, R., Tkach, J. M., Vierling, E., Glover, J. R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104. J Biol Chem. 279, 29139-29146 (2004).
- Tessarz, P., Mogk, A., Bukau, B. Substrate threading through the central pore of the Hsp104 chaperone as a common mechanism for protein disaggregation and prion propagation. Mol Microbiol. 68, 87-97 (2008).
- Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell. 119, 653-665 (2004).
