Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.
A placenta é responsável para o transporte de nutrientes, gases e factores de crescimento para o feto, bem como a eliminação de desperdícios. Assim, defeitos de desenvolvimento da placenta ter importantes conseqüências para o feto ea mãe, e são uma das principais causas de letalidade embrionária. O principal tipo de célula da porção fetal da placenta é o trofoblasto. Primários de rato trofoblasto da placenta é uma ferramenta útil para o estudo do desenvolvimento normal e anormal da placenta, e ao contrário de linhas de células, pode ser isolado e utilizado para estudar trofoblasto em fases específicas da gravidez. Além disso, a culturas primárias de trofoblasto de ratinhos transgénicos podem ser utilizados para estudar o papel de genes específicos em células da placenta. O protocolo aqui apresentado é baseado na descrição por Thordarson et al. 1, no qual um gradiente de Percoll é usado para obter uma população de células relativamente puro trofoblasto da placenta de rato isolados. Ele é similar ao utilizar mais amplamented humano métodos para isolamento 2-3 trofoblasto célula. A pureza pode ser avaliada por coloração imunocitoquímica das células isoladas para citoqueratina 7 4. Aqui, as células isoladas são então analisadas utilizando um ensaio de invasão para avaliar a capacidade de invasão de matrigel trofoblasto in vitro 5-6. As células invadidas são analisados por imunocitoquímica e coradas para contagem.
Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células trofoblásticas da placenta de rato. Depois, mostramos um ensaio in vitro para a invasão do trofoblasto. Utilizando este procedimento, uma grande parte, mas não totalmente, população pura de células trofoblásticas pode ser obtida. Se a pureza é necessária mais, separação magnética ou grânulo de citometria de fluxo pode ser realizada, como já foi descrito para as células trofoblásticas humanas primárias. O comprimento adequado do passo de dissociação c…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer à equipa Serviços Criativos da Universidade de Missouri Centro de Apoio Acadêmico, que produziu este vídeo. Este trabalho foi financiado pelo Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Development Saúde e Humanos do Instituto Nacional de Saúde, subvenção número HD055231
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
Reagent | Amount | Final concentration |
10x Medium 199 | 50ml | 1X |
Hepes | 2.383 g | 0.02M |
sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
Reagent | Amount | Final concentration |
Wash Solution | 100 mL | |
DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
DNase | Sigma | D4263 | |
100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.