Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Summary

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Abstract

A placenta é responsável para o transporte de nutrientes, gases e factores de crescimento para o feto, bem como a eliminação de desperdícios. Assim, defeitos de desenvolvimento da placenta ter importantes conseqüências para o feto ea mãe, e são uma das principais causas de letalidade embrionária. O principal tipo de célula da porção fetal da placenta é o trofoblasto. Primários de rato trofoblasto da placenta é uma ferramenta útil para o estudo do desenvolvimento normal e anormal da placenta, e ao contrário de linhas de células, pode ser isolado e utilizado para estudar trofoblasto em fases específicas da gravidez. Além disso, a culturas primárias de trofoblasto de ratinhos transgénicos podem ser utilizados para estudar o papel de genes específicos em células da placenta. O protocolo aqui apresentado é baseado na descrição por Thordarson et al. ^1, no qual um gradiente de Percoll é usado para obter uma população de células relativamente puro trofoblasto da placenta de rato isolados. Ele é similar ao utilizar mais amplamented humano métodos para isolamento ^2-3 trofoblasto célula. A pureza pode ser avaliada por coloração imunocitoquímica das células isoladas para citoqueratina 7 ^4. Aqui, as células isoladas são então analisadas utilizando um ensaio de invasão para avaliar a capacidade de invasão de matrigel trofoblasto in vitro ^5-6. As células invadidas são analisados ​​por imunocitoquímica e coradas para contagem.

Protocol

1. Dissecção da placenta do mouse Configure pares de acasalamento dos ratos. Em cada um dos dias seguintes, para verificar a presença de um tampão copulatório. O dia em que é detectada uma ficha é considerada 0,5 dias pós-coito (dpc) 7. Placentas podem ser obtidas na fase desejada da gestação, com uma dissecção limpa do início placenta possível com o desenvolvimento da placenta madura em d 10,5. Aqui, nós demonstramos 14,5 dpc. Nos volumes indicad…

Discussion

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células trofoblásticas da placenta de rato. Depois, mostramos um ensaio in vitro para a invasão do trofoblasto. Utilizando este procedimento, uma grande parte, mas não totalmente, população pura de células trofoblásticas pode ser obtida. Se a pureza é necessária mais, separação magnética ou grânulo de citometria de fluxo pode ser realizada, como já foi descrito para as células trofoblásticas humanas primárias. O comprimento adequado do passo de dissociação c…

Materials

Specific reagents and equipment:

Wash Solution (filter sterilize after mixing)

Reagent	Amount	Final concentration
10x Medium 199	50ml	1X
Hepes	2.383 g	0.02M
sodium bicarbonate	0.42 g	0.01M
Penicllin-Streptomycin	5 mL	100 U- 100 μg /ml
Sterile dH20	to 500 mL

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)

Reagent	Amount	Final concentration
Wash Solution	100 mL
DNase	1 vial (2000 U)	20 U/mL
Collagenase	100 mg	125 digestion units/mL

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Collagenase	Sigma	C9891	This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well
NCTC-135	Sigma	D4263	Add FBS to 10%
Matrigel invasion chambers	BD Biosciences	354481
10x Medium 199	Sigma	M9163
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140
DNase	Sigma	D4263
100 μm Cell strainer	Fisher	22363549
Antibody to cytokeratin 7	DAKO	M7018	Used at 1:100 dilution

Equipment
Standard cell culture equipment including a CO₂ incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.