عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن تصف تشريح المشيمة من الماوس على الحمل d10.5، تليها عزل خلايا الأرومة الغاذية باستخدام التدرج Percoll. علينا أن نبرهن ثم استخدام الخلايا المعزولة في مقايسة الغزو matrigel.
Abstract
المشيمة هي المسؤولة عن نقل الغازات، والمغذيات وعوامل النمو على الجنين، وكذلك القضاء على النفايات. وهكذا، عيوب في التنمية المشيمة لها آثار هامة على الجنين والأم، وهي سبب رئيسي من الفتك الجنينية. نوع من الخلايا الرئيسية للجزء من المشيمة الجنين هو الأرومة الغاذية. الأولية خلايا فأر الأرومة الغاذية المشيمة هي أداة مفيدة لدراسة التنمية المشيمة طبيعية وغير طبيعية، وعلى عكس خطوط الخلايا، قد تكون معزولة وتستخدم لدراسة الأرومة الغاذية في مراحل معينة من الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الثقافات الأولية من الأرومة الغاذية من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة دور جينات معينة في خلايا المشيمة. ويستند بروتوكول المعروضة هنا على وصف من قبل Thordarson وآخرون. 1، والذي يستخدم في الانحدار percoll للحصول على الخلايا الأرومة الغاذية نقي نسبيا من السكان مشيمة الماوس معزولة. وهو يشبه إلى استخدام أكثر على نطاق واسعد طرق الإنسان الأرومة الغاذية الخلية 2-3 العزلة. يمكن تقييم النقاء من تلطيخ immunocytochemical للخلايا معزولة عن cytokeratin 7 4. هنا، ثم يتم تحليل الخلايا المعزولة باستخدام مقايسة الغزو matrigel لتقييم الغزو الأرومة الغاذية في المختبر 5-6. ويتم تحليل الخلايا التي غزتها كيمياء سيتولوجية مناعية والملون لفرز الأصوات.
Protocol
Discussion
في هذا الفيديو، ونحن تثبت عزل خلايا الأرومة الغاذية من المشيمة الماوس. ثم نعرض لفحص المختبر في الأرومة الغاذية للغزو. باستخدام هذا الإجراء، وإلى حد كبير، ولكن ليس تماما، يمكن الحصول على السكان نقية من خلايا الأرومة الغاذية. إذا كان مطلوبا المزيد من النقاء، يمكن أن يؤ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر فريق الخدمات الإبداعية في جامعة ميسوري مركز الدعم الأكاديمي الذي أنتج هذا الفيديو. وأيد هذا العمل من قبل كينيدي شرايفر يونيس المعهد الوطني للصحة والتنمية البشرية للأطفال من المعاهد الوطنية للصحة، ومنحة عدد HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| 10x Medium 199 | 50ml | 1X |
| Hepes | 2.383 g | 0.02M |
| sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
| Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
| Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
| Reagent | Amount | Final concentration |
| Wash Solution | 100 mL | |
| DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
| Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
| NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
| Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
| 10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| DNase | Sigma | D4263 | |
| 100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
| Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
