单细胞的表达谱可以详细的单个细胞的基因表达分析。我们描述为心肌细胞隔离的方法,并编制要么全转录组微阵列或qPCR的具体目标产生的裂解物。
虽然许多研究都从心脏组织匀浆研究基因表达的变化,这样可以防止一个组织内的细胞之间的固有的随机变异研究。纯粹通过胶原酶灌注小鼠心脏心肌人口的分离,有利于全转录基因表达的单细胞微阵列的一代,或使用纳流控阵列的具体目标的qPCR。我们在这里描述一个过程来研究单个细胞基因的表达谱,从心脏分离心肌。这种范式允许利益的指标是不依赖于均值(例如一个组织内的细胞之间的差异),这是不可能的基因表达的评价(图1)当使用传统的整个组织工作流程的评价。我们已经取得了强大的扩增双链cDNA的单细胞转录高产微克,有利于我用的芯片ndividual细胞。在此过程中,我们描述的NimbleGen阵列易于使用和定制其设计能力选择使用。另外,逆转录 – 具体目标扩增反应(RT – STA)的,允许数以百计的纳流控PCR扩增目标的qPCR。使用这些方法之一,它是研究细胞之间的变异性的表达,以及表达谱研究从组织内一个罕见的细胞类型。总体而言,单细胞基因表达的方法可以生成的数据,可以潜在地识别配置文件,通常平均在审查从整个组织产生的典型匀浆数以百万计的细胞表达的特异表达。
这种方法有可能产生的功能以及基因表达研究心肌。检查单细胞基因表达分析中的一个新兴领域。研究在单细胞水平的转录水平的优势在于,它允许一个纯粹的细胞群,这是没有可能从整个组织的筹备工作检查。此外,单细胞分析允许为单个细胞中的mRNA水平的随机变异的检查,以定义单元,以前被认为是同质8,9人口。除了 确定的基因有可能在他们的基因表达10,11,12随机,该方法还允许为特定人群的罕见细胞基因表达谱鉴定。
虽然这种方法提供了一个令人兴奋的潜在用途,基因表达分析,有SOM发送警告和注意事项,使用单细胞。单细胞分析的主要限制因素,是在实验中收集足够的细胞,例如方差,实现利益的度量方面的统计意义。在地方利益的组织细胞的数目是不是限制的情况下,可以检查数百个细胞每组,使用方法,如新一代测序,或纳流控阵列。然而,在某些情况下,有可能难以取得足够的细胞从组织利益。这可以部分特质针对性的细胞类型的集合时间密集型程序引起的。然而,精心的策划和单细胞采集出发前准备,可能仍然允许进行严格的单细胞分析与有限的技术性错误。当研究必须考虑的结果,即使隔离细胞的程序已经在众多studie使用S(包括显微镜,电等),隔离本身可能会影响基因的表达。至于用任何方法操纵生物样品,你的调查结果结果应仔细验证,以确保单个细胞中的表达是代表组织本身,而不是技术偏见。如原位杂交的方法可以证明是有用的的,完整的组织,以验证这些结果。最后,关键是要确保生成的数据是经过精心的质量控制检查。如图8所示的数据表明,qPCR实验可能会非常强劲,其特殊性,如法#13(A13),或有高层次的变化,从而导致检测#34(A34)的技术,如方差。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢在本议定书的拍摄技术援助C. Zambataro。我们非常感谢为弥敦道冲击中心奖葛兰基金会的医学研究(SM),希尔布鲁姆的基础,和国立卫生研究院(P30AG025708)和PO1AG025901支持。 JMF的支持T32AG000266关于老龄问题的巴克研究所的研究授予。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Collagenase, Type I | Worthington | C9891 | |
1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, | PN T0221 | |
BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
Sodium Pentobarbital | Henry Schein Vet. Supply* | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
ExoSAP IT | Affymetrix/USB | 78201 | |
CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent | 7500 kit | |
One Color Labeling kit | Roche-NimbleGen | 5223555001 | |
Mus Musculus 12x135k array | Roche-NimbleGen | 5543797001 | |
GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |