Summary
I artikeln presenteras protokoll av inneboende optiska signaler och flavoproteins autofluorescens signaler imaging att kartlägga lukt-framkallat aktiviteter på ytan av luktbulben hos möss.
Abstract
I hjärnan aktiverar sensorisk stimulering fördelade populationer av nervceller bland funktionella moduler som deltar i kodningen av stimulans. Funktionella optiska avbildningstekniker är fördelaktiga att visualisera aktivering av dessa moduler i sensoriska cortex med hög rumslig upplösning. I detta sammanhang endogena optiska signaler som uppstår molekylära mekanismer kopplat till neuroenergetics är värdefulla källor till skillnad från att spela in rumsliga kartor över sensoriska stimuli över vidsträckta fält i gnagare hjärnan.
Här presenterar vi två tekniker som bygger på förändringar av endogena optiska egenskaper i hjärnan vävnad under aktivering. Först inneboende optiska signaler (IOS) produceras av en lokal förändring i rött ljusreflektion beror på: (i) av förändringar i blodets syresättning nivå och blodvolym (ii) photon scattering absorption. Användningen av in vivo IOS för att spela in rumsliga kartor började i mitten av 1980-talet med observatipå optiska kartor över morrhår fat hos råtta och kolumnerna orientering i katten syncentrum 1. IOS avbildning av ytan av gnagare viktigaste luktbulben (OB) som svar på doftämnen som senare visat Larry Katz grupp 2. Den andra strategin bygger på flavoprotein autofluorescens signaler (FAS) på grund av förändringar i redox tillståndet för dessa mitokondriella metaboliska intermediärer. Mer exakt är tekniken baserad på grön fluorescens på grund av oxiderat tillstånd flavoproteins när vävnaden är glada med blått ljus. Även om sådana signaler var förmodligen bland de första fluorescerande molekyler in för att studera hjärnans aktivitet genom pionjär studier av Britton chanser och kollegor 3, var det inte förrän nyligen att de har använts för kartläggning av hjärnans aktivering in vivo. FAS avbildning tillämpades för första gången till den somatosensoriska cortex hos gnagare som svar på hindpaw stimulering av Katsuei Shibuki grupp 4.
Luktsinnet är av central betydelse för överlevnaden av de allra flesta levande arter eftersom det tillåter effektiv upptäckt och identifiering av kemiska ämnen i miljön (mat, rovdjur). Det OB är det första reläet i luktsinnet informationsbehandling i hjärnan. Den tar emot afferenta prognoser från luktsinnet primära sensoriska nervceller som känner av flyktiga doftämnen. Varje sensoriska neuron uttrycker endast en typ av luktreceptor och nervceller bära samma typ av receptor skickar sina nervtrådar till samma väldefinierade mikroregioner av ~ 100μm 3 består av diskreta neuropil, lukt glomerulus (Fig. 1). Under det senaste decenniet har IOS imaging främjat den funktionella undersökning av OB 5, 6, 7, som har blivit en av de mest studerade sensoriska strukturer. Kartläggningen av OB aktivitet med FAS avbildning har inte genomförts ännu.
Här we visa fotstegen av ett effektivt protokoll för IOS och FAS avbildning att kartlägga lukt-framkallade verksamhet i musen OB.
Protocol
1. Förbereda djuret för avbildning (i enlighet med europeiska rekommendationer för vård och användning av försöksdjur, 86/609/EEG direktiv)
- 6 till 8 veckor gamla C57BL6 hanmöss bedövas med en cocktail av ketamin (10mg/kg) och xylazin (100mg/kg) injiceras intraperitonealy. Kirurgi börjar när musen reagerar inte längre hindpaw nypa. Under hela försöket djuret placeras på en värmedyna. Kroppstemperaturen kontinuerligt övervakas och hålls vid 37 ° C. Anestesidjupet bibehålls under hela operationen och bildbehandling session genom att kolla in avsaknaden av lem dra sig tillbaka. En subkutan injektion av 20% av den ursprungliga bedövning cocktail är annars administreras.
- Använda hårklippningsmaskiner, ta bort hår från hårbotten. Rengör den exponerade huden från rester av hår med hjälp av steril gasbinda indränkt med koksaltlösning.
- Placera musen i stereotaxic ramen. Nosen måste vara i samma plan som baksidan av huvudet,för att fastställa ytan av luktbulben mot horisontalplanet. Säkra ordentligt i örat och barer näsa för att undvika rörelser under avbildning.
- Applicera oftalmologiska salva på djurets ögon att förhindra uttorkning och smärta.
- Desinficera alla kirurgiska instrument med 70 ° etanol och hårbotten området med varandra svep av Betadine.
- För att ta bort hud som täcker skallen, börja med att göra ett snitt i huden med en sax på baksidan av huvudet mellan öronen. Klipp på båda sidor mot basen på örat och i anteroposterior riktning mot pannan längs ögonlocken. Avsluta bort hårbotten genom att skära huden ovanpå nosen nära näsan baren.
- Enligt kikare observation, använd en bomullstuss indränkt med koksaltlösning för att försiktigt lossa periostet på toppen av skallen. Använd en pincett för att ta bort de kvarvarande vävnad och skrapa på ytan av skallen med en skalpell för att ha en ren förberedelse.
- Den OB är en symmetrisk struktur som består av två hemibulbs som ligger mellan ögonlocken. De är begränsade i rostralt och i caudal riktning genom en vensinustrombos och åtskilda av sagittal sutur. Placera en bit absorberbara gelatin svamp indränkt med destillerat vatten på benet ovanför OB. Det är viktigt att hålla detta ben området fuktigt under hela försöksperioden.
2. Förbereda kraniella fönster
- Ta bort gelatinet svampen och börja med att försiktigt skrapa benet med n ° 10 skalpell blad. Håll en konstant vinkel på 45 ° mellan blad och ben och flytta bladet från ögonlock till sagittala sidan av glödlampan området. Applicera inte vertikalt tryck på ben eller repa benet ovanför venösa sinus.
- Under gallring processen stanna varje 5min och placera en hydrerad gelatin svampen på benet för att kyla ner beredningen. Provstickan skallen med svampen för att ta bort ben damm.
- Håll svepande ochkylning alternativt tills visualisera trabekelantal, den porösa benet lagret. Den fina kärlen i OB måste vara synlig i detta skede. Sluta klia benet, och börja använda skalpell är spets vinkelrätt mot "dra" en rektangulär yta innesluter OB. I detta skede n ° 11 skalpell blad kan användas. Håll operation inom ramen för venös bihålorna som bör säkra någon skalpell stroke.
- Gräv gradvis bildas rektangulära diket med hjälp av successiva rörelser av skalpell. Torka av spetsen på skalpellen jämna mellanrum för att rengöra den och hålla den skarp. Var extra försiktig med djupet i spetsen för att undvika att röra vid dura ytan.
- För att få en känsla av tjockleken på resterande ben, tryck den försiktigt med spetsen på en pincett. Om benet luckan veck under press, gå vidare till nästa steg.
- Enligt en droppe koksaltlösning, använd toppen av skalpell orienterade horisontellt för att lyfta upp benet fliken. Borttagandet av luckan måste göras Carefully för att undvika att riva av de resterande ben.
- När OB yta är utsatt, kontrollera om det inte finns någon blödning eller blodkärl anastomos. Skadade dura eller i vävnaden ytan kommer att minska chanserna att få optiska signaler. Torka området med en gelatin svamp indränkt i saltlösning för att hålla lampan fuktig.
- Applicera polyakrylat dentala cement till en bra bit på benet runt fönstret.
- Placera en droppe låg smältpunkt Agar (1,2%) över duran, och sätta en steril skyddsglas på måtten i fönstret. Under avbildning session kan en liten mängd agaros läggas till för att kompensera uttorkning. Agarosen kommer att hindra OB från att röra sig med andningen och ger en slät yta för optisk avbildning.
3. Optisk avbildning setup för olfactory aktivitet kartläggning
- Den lukt stimulering måste definieras i tid och intensitet med hjälp av en olfactometer. Vi använder en anpassad modifierad version av multivial perfusion systemet Valvebank 8II från Automatisera Scientific i samband med en grundläggande luftkompressor (komprimerad andningsluft skulle passa också). Detta system möjliggör noggrann och snabb extern ventilstyrning. Lösningar av ren luktämnen späds ut i mineralolja på vald koncentration. För att aktivera rygg OB aldehyder som hexanal används ofta. En exakt volym av det utspädda luktämnen (20 till 50μl) lastas på ett filterpapper och placeras i en spruta reservoar. Genom perfusionen systemet är tryckstyrd luft som levereras till systemet, vilket garanterar en konstant hastighet av luktsatt luft flöde leverans till djuret näsan under ventilöppning. Luktämnen levereras genom en Tygon R-3603 Vacuum Tubing (Saint-Gobain Corporation) som transporterar luft vid ett flöde på ~ 1000ml/min. Undvik kontaminering mellan doftämnen och kvarvarande mängder av luktämnen i slangen. Om möjligt kan reproducerbarhet luktämnen stimulans vara controlled hjälp av en flamjonisationsdetektor (microFID 2020 Photovac).
- Den optiska installationen är påslagen. Den består av en kyld sammanflätad 12 bitar CCD-kamera (ORCA AG Hamamatsu) associerad med en fluorescens stereomikroskop (Leica MZ16), en datorstyrd olfactometer och stabiliserade lampor excitation med lämpliga filter bandpass störningar. Ett system som beskriver vår inställning ges i figur 2. För Intrinsic optiska signaler Imaging (IOSI), en 200W volfram halogenlampa (Oriel QTH) tillsammans med en fiberring ljus (Schott) inkopplad runt mikroskop mål används för att ge stabil och jämn belysning. För Flavoprotein autofluorescens Signaler Imaging (Fasi), en 150W metallhalogen lampa (Leica) med en 5mm kärna flytande ljus guide ger även lokal excitation av fluorescens genom epi-belysning port stereomikroskop.
Bild förvärv och hårdvara synkronisering realiseras genom skräddarsydda program. Den öppna sOurce programvara Micromanager kan också användas för att styra den optiska setup och förvärv.
4. Optisk avbildning
- Placera stereotaxic ramen under stereomikroskop, den kraniala fönster centrerad i synfältet (se bild. 2A för en schematisk av den optiska inställning).
- Ställ in mikroskop för att fokusera på kapillärerna. Före stimulering prövningar (se beskrivning i 5) är en bild av lampan fattas enligt 560nm (grön) lampa (fiber ring) som ger en bra kontrast till blodkärl avbildning. Denna bild används som en anatomisk kontroll för att kontrollera tillståndet i förberedelserna och förvärvas flera gånger under experimentet.
- För IOS bildbehandling, reflekterade ljusintensitet registreras av CCD-kameran i 630 + / -10 nm (rött) belysning. Bilderna förvärvas med full frame (ingen binning) vid 5 bilder per sekund vilket motsvarar en exponeringstid på ca 150ms. Effekt av ljuskällan ställs på nytt ACH gråskalenivåer på minst ~ 3000 på OB-området, nära mättnad CCD pixlar brunnar. Om du gör det gör det möjligt att dra nytta av 12bits dynamiken i CCD att fånga svaga intensitet ändras under aktiveringen. Maximal IOS amplitud når ~ 1%.
- För FAS avbildning fluorescens har förvärvats enligt excitation av 480nm + /-20nm (blå) epiflurorescence ljus. Ett högpassfilter vid 515nm är inrättat för att fånga ljuset. Bilderna förvärvas till 5 bilder per sekund med en binning på 4 av 4 för att maximera känsligheten. Excitation ljus strömmen justeras på samma sätt som IOS med grå nivåer av 3000 på OB-området. Maximal FAS amplitud når ~ 3%.
För båda avbildningsmetoder, är skärpedjupet i ämnet planet samma och mättes till 0,5 mm för en förstoring av ca fyra gånger.
- Ljuset ska vara avstängd mellan avbildning försök att undvika uppvärmning och fotoblekning av preparatet.
- Standard avbildning session ingår ett utgångsvärde på 5 till 10s där bara luft levereras, följt av lukt stimulering för 3 till 10s beroende på vald lukt koncentration, och 70 till 82s är ytterligare in med ett konstant luftflöde för baslinjen återvinning (Fig. 2A). Vid slutet av rättegången, är ljus avstängd och ren luft levereras till bland rättegången intervallet varaktighet (1 till 3 minuter) att tvätta bort kvarvarande lukt molekyler och undvik sensoriska tillvänjning. Lukt studierna interfolierade med tomma försök (lufttillförsel).
- Lukt-evoked aktiverade zoner visualiseras som grovt sfäriska områden på kartorna och motsvarar storleken på de enskilda glomeruli (80 till 200μm i diameter 9). Bildbehandling förklaras i figur 2b. Lukt kartorna presenteras i figur 3. I motsats till alla andra sensoriska system, var det signal-brus-förhållandet i OB tillräckliga för att lösa lukt-evoked potential i enkel studier (Fig. 3B för IOS och Bild. 3D för FAS).
- Möss är avlivas omedelbart vid slutet av avbildning sessionen med hjälp av metoder i enlighet med europeiska rekommendationer för vård och användning av försöksdjur.
6. Representativa resultat (se lukt kartorna i figur 3):
Figur 1 organisationsstruktur de viktigaste luktbulben hos gnagare. Lukt sensoriska neuroner, primära sensoriska celler som finns i de viktigaste luktepitel uttrycka samma luktreceptor och sammanstrålar på samma glomeruli i OB. Lukt glomeruli, den runda neuropils (streckad cirklar), finns på ytan av OB. Observera att en mycket tät och komplex vaskulära nätverket är närvarande vid glomerulära nivå. Förkortningar (top / ned): ENDA: luktnerven lager, GL: glomerulär lager, EPL: extern plexiform lager, MCL:mitral cellager; GCL: granulat cellager.
Figur 2 reflektans och fluorescens signaler spela in vivo. A. Wide-området optisk avbildning setup. Hjärnan i en sövda mus utsätts för antingen röd (IOS) eller blå (FAS) ljus genom antingen en ringformig fiberring knutna till den optiska linsen eller en epi-belysning hamnen i ett mikroskop. Lukter lastas i förseglade flaskor och luktsatt luft levereras till djuret näsan (grönt ljus: öppen ventil). B. Inspelning protokoll och databehandling. IOS och FAS redovisas som serie individuella prövningar (90-talet av duration). Diagrammet visar tidslinje av en enda rättegång: baslinje varierar från 5 till 10s, stimulans från 3 till 10s, och återgår till utgångsvärdet från 70 till 82s. Bildbehandling kräver pixel-för-pixel subtraktion av styrka värden under baslinjen till intensiteten värden under perioder av stimulering (för FAS) or stimulering plus återvända till baslinjen (för IOS). Denna skillnad delas sedan med utgångsvärden för att få en variation i% (se resulterande bilderna i bild. 3).
Figur 3 Lukt-framkallat aktivitet kartor i OB med IOS och FAS avbildning. A. vaskulatur av rygg-OB visualiseras under grönt ljus. BC. IOS avbildade (enda rättegång mot tre genomsnitt prövningar respektive) för en 10s presentation av 20% hexanal. Vita pilar visar den sfäriska områden av intresse aktiveras av denna lukt. Dessa aktivering kartor erhölls genom att använda ramar i genomsnitt under den första sekunden efter lukt stimulering (högst reflektansen variation -0,63% i A och -0,52% i B). Notera de svarta områdena i absorbans där lukt aktivering har skett. CD. FAS förvärvade sekventiellt i samma musen för samma luktämnen (enda rättegång mot tre genomsnitt studier respektively). Dessa aktivering kartor erhölls genom att använda ramar i genomsnitt under den första sekunden efter början av lukt stimulering (högst fluorescens variation 0,72% i D och 0,66% i E). Observera att de vita zoner autofluorescens utsläpp anges med svarta pilar motsvarar den svarta zoner i IOS. Den korniga aspekten ses i FAS kartan beror på att 4 av 4 binning krävs för att förbättra känsligheten. FAS bilder var inte korrigerats från autofluorescens blekning. Faktisk dimensioner av bilderna: 0,7 mm bred x 1,2 mm lång.
Discussion
I denna artikel presenterar vi IOS och FAS avbildningstekniker för in vivo-inspelningar av lukt framkallade-verksamhet i musen OB. För att uppnå detta mål en relativt enkel och prisvärd brett fält optisk avbildning installation är nödvändig. Den bilddata krävs utbildning för att utföra de fina kirurgiska ingrepp och undvika skada på dura eller hjärnvävnad. I synnerhet kommer större blödning absorbera fotoner registreras för avbildning och till slut experimentet.
En fördel med IOS och FAS avbildning är att undvika injektion av fluorescerande spårämnen som kan leda till cellulär toxicitet eller oönskade biverkningar. De gör det möjligt att hantera frågor om lukt kartor därmed rumsliga kodning av sensoriska stimuli. I motsats till 2-DeoxyGlucose bildbehandling, ger de möjlighet till bild flera lukt i ett enda djur. Eftersom fotonen penetrationen är begränsad i vävnaden, är IOS och FAS begränsad till ryggdelen av OBoch kan inte spelas in från ventrala regioner.
Endogena optiska signalen avbildning erbjuder utmärkt rumsliga upplösningen för in vivo imaging. Tekniska förbättringar gäller kvantitativa beräkningar av vaskulära komponenter i reflektansen signalerna 8,9 samt dynamik blodets syresättning och volym under sensorisk aktivering 10. Multiwavelength avbildning av IOS avbildning metoder finns för närvarande utvecklas i vårt laboratorium för att till fullo kvantifiera total hemoglobinkoncentration och syresättning i OB under sensorisk aktivering. Dessa spektroskopiska optiska mätningar läggas till FAS imaging kommer att ge möjlighet att besvara de olösta förhållandet mellan kärl-och intracellulära dynamik under sensorisk aktivering 11,12.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av "Agence Nationale de la Recherche" bevilja ANR-09-JCJC-0117-01 och "Neuropôle de Recherche Francilien-nerf" bidrag för Romain Chery. Vi tackar Françoise Lefebvre för programvaruutveckling i C + + / Qt, och Laurent Pinot och Batiste Janvier om hjälp i utvecklingen av optisk avbildning setup.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imalgene | Merial | ||
| Rompun | Bayer AG | ||
| Agarose, type III-A | Sigma-Aldrich | A9793-50G | |
| Hexanal 98% | Aldrich | 115606-100ML |
References
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Rubin, B. D., Katz, L. C. Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb. Neuron. 23, 499-511 (1999).
- Chance, B., Cohen, P., J&246, bsis, &, F., Schoener, B.
- Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence. J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).
- Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).
- Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake. Neuron. 52, 335-345 (2006).
- Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb. Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).
- Meister, M., Bonhoeffer, T. Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).
- Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation. Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).
- L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations. Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).
- Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper). Photonics West Conference, , (2011).
