光反射率と自家蛍光信号を用いたマウス嗅球におけるイメージングの臭い誘発活動

Summary

この記事では、マウスの嗅球の表面にマップ臭気誘発活動に固有の光信号とflavoproteins自家蛍光信号のイメージングのプロトコルを示す。

Abstract

脳では、感覚刺激は、刺激のコーディングに参加する機能モジュール間のニューロンの分散集団を活性化する。機能性光学イメージング技術は、高い空間分解能と感覚皮質におけるこれらのモジュールの活性化を可視化するために有利である。この文脈では、neuroenergeticsにリンクされている分子メカニズムから生じる内因性光信号は、齧歯類の脳における幅広い分野にわたって感覚刺激の空間マップを記録するためにコントラストの貴重な情報源です。

ここで、我々は、アクティベーション時の脳組織の内因性光学的性質の変化に基づいて2つの手法を提示する。血液の酸素化レベルと血液量の変化（II）光子の散乱による（ⅰ）吸収：最初の内因性光信号（IOS）はによる赤色光の反射率の局所的変更によって生成されます。空間マップを記録するために生体 IOS での使用は、1980年代半ばobservatiとで開始ラットにおけるウィスカーバレルとネコ視覚野¹の方向の列の光学地図の上に。匂い物質に対する応答の齧歯類主嗅球（OB）の表面のIOSイメージングは、後にラリーKatzのグループ²で実証された。二番目のアプローチはこれらのミトコンドリアの代謝中間体の酸化還元状態の変化によるフラビン自家蛍光信号（FAS）に依存しています。より正確には、技術が組織に青色光によって励起さflavoproteinsの酸化状態に起因する緑色の蛍光に基づいています。そのような信号がブリトンのチャンスと同僚³のパイオニアの研究により、脳活動の研究のために記録された第1の蛍光分子間でおそらくあったものの、それは彼らがin vivoでの脳の活性化のマッピングに使用されていることが最近までなかった。 FASの画像が最初にKatsuei Shibukiのグループ⁴で後足の刺激に応答して、げっ歯類における体性感覚野に適用した。

それは環境中の化学物質の効率的な検出と同定（食品、捕食者を）できるため、嗅覚系は、生物種の大多数の生存のために極めて重要である。 OBは、脳内の嗅覚情報の処理の最初のリレーです。それは、揮発性の匂い分子を検出する嗅覚の一次感覚ニューロンからの求心性投射を受け取ります。それぞれの感覚ニューロンは〜100μmの³の同じ明確に定義されたmicroregionsに彼らの神経プロセスを送っ受容体の同じタイプを運ぶ嗅覚受容体と神経細胞の1種類のみの離散ニューロ、嗅覚糸球体（図1）から構成を表現する。過去10年間では、IOSイメージングは最もよく研究感覚な構造のひとつとなっており、OB ^5、6、7の機能的な探査を促進しています。 FASイメージングとOBの活動のマッピングがまだ実行されていません。

ここで、wEマウスのOBの臭い誘発活動をマッピングするIOSおよびFASイメージングのための効率的なプロトコルの連続した​​手順を示しています。

Protocol

1。イメージングのために動物を準備する（実験動物の管理と使用のためのヨーロッパの勧告に従い、86/609/EEC指令）

1. 6〜8週の古いC57BL6雄マウスは、腹腔内注入したケタミン（10mg/kgより少ない）とキシラジン（100mg/kg）のカクテルで麻酔する。マウスは、もは​​やピンチを後足に応答しない場合に手術が開始されます。全体の実験中に動物を加熱パッド上に配置されます。体温は連続的に監視、37℃に維持する麻酔の深さは、四肢の不在撤退をチェックアウトして手術とイメージングセッションを通じて維持される。最初の麻酔薬のカクテルの20％の皮下注射は、そうでない場合に投与される。
2. バリカンを使用して、頭皮から髪を削除する。生理食塩水に浸した滅菌ガーゼを使用して残留髪から露出した肌を清掃してください。
3. 定位フレームにマウスを置きます。鼻は、頭の背面と同一平面上に配置する必要があります水平に嗅球の表面を設定するために。撮像中に動きを防ぐためにしっかりと耳と鼻のバーを固定します。
4. 乾燥や痛みを防ぐために、動物の目に眼軟膏を適用します。
5. 70℃のエタノールとbetadineの連続スイープと頭皮の面積を持つすべての手術器具を消毒する。
6. 頭蓋骨を覆う皮膚を削除するには、耳の間に頭の後ろではさみで皮膚に切開を作ることから始めます。その後、耳の付け根に向かってまぶたに沿って額に向かって前後方向の両側にカット。鼻のバーに近い鼻の上に皮をカットすることで頭皮の削除を完了。
7. 両眼観察下で、静かに頭蓋骨の上に骨膜をデタッチするには生理食塩水に浸した綿棒を使用してください。残りの組織を除去してクリーンな準備を持っているメスで頭蓋骨の表面をこすり取る際には、ピンセットを使用してください。
8. OBは、まぶたの間に置かれている2台のhemibulbsから成る対称構造である。彼らは、静脈洞によって吻側と尾側方向に限られており、矢状縫合で区切られています。 OB上の骨に蒸留水に浸漬させた吸収性ゼラチンスポンジの部分を置きます。実験を通してこの骨領域が湿った状態にしておくことが重要です。

2。頭蓋窓の準備

1. ゼラチンスポンジを外し、ゆっくりとN ° 10手術用メスの刃に骨をこす​​ることから始めます。ブレードと骨の間に45 °の一定の角度を維持し、まぶたから電球の地域の矢状面に刃を移動する。骨に垂直に圧力をかけたり、静脈洞、上記の骨は傷をつけないでください。
2. 薄化プロセス中に、すべての5分を停止し、準備を冷却するために骨に水和したゼラチンスポンジを置く。綿棒骨の粉塵を除去するためにスポンジと頭蓋骨。
3. 抜本的な保管と梁、海綿骨の層を可視化するまで交互に冷却する。 OBの微細な血管系は、この段階で表示されている必要があります。骨を傷つけない停止、およびOBを囲む矩形領域を"描く"に垂直にメスの先端を使って起動する。この段階でn ° 11手術用メスの刃を使用することができます。どんなメスストロークの安全なはず静脈洞の範囲内で手術をしてください。
4. メスの連続した​​動きを使用して徐々に形成された長方形の溝を掘る。それをきれいにし、それがシャープに保つために定期的にメスの先端を拭きます。硬膜の表面に触れないように先端の深さの余分な注意が必要です。
5. 残りの骨の厚さの感覚を得るためには、ピンセットの先端で軽く押し込みます。圧力下の骨フラップ折りの場合、次のステップに移動します。
6. 生理食塩水の低下の下で、骨弁を持ち上げて水平にメス型の先端を使用してください。フラップの除去は、cを行う必要がありますarefully残りの骨をティアオフ避けるために。
7. OBの表面が露出されると、任意の出血や血管の吻合がないことを確認してください。硬膜または組織表面を傷つけると、光信号を得る可能性を減らすでしょう。電球の潤いを保つために生理食塩水に浸したゼラチンスポンジでエリアを拭いてください。
8. ウィンドウの周りの骨に井戸を形成するポリアクリレート歯科用セメントを適用します。
9. 硬膜上に低融点アガロース（1.2％）の低下を置き、ウィンドウの大きさで滅菌カバーグラスを置く。イメージングセッション中に、アガロース少量の乾燥を補うために追加することができます。アガロースは、呼吸で動くからOBを防止し、光学イメージングのための平らな表面を提供します。

3。嗅覚の活動のマッピングのための光学イメージングセットアップ

1. 嗅覚刺激は、正確に嗅覚の使用によって、時間と強度で定義されている必要があります。我々は、基本的な空気圧縮機（圧縮通気空気も同様に適していることでしょう）に関連付けられている自動化科学からmultivial灌流システムValvebank 8IIのカスタム修正版を使用してください。このシステムは、正確かつ迅速に外部のバルブ制御が可能になります。純粋な匂いのソリューションは、選択された濃度でミネラルオイルで希釈されています。などヘキサナールなどの背OBアルデヒドを有効にするには、一般的に使用されています。希釈匂い（20〜50μlの）の正確な量は、ろ紙上にロードし、注射器のタンクに配置されます。灌流系を介して、圧力制御された空気は、バルブ開度時の動物の鼻にodorized空気フラックスの配信の一定割合を確保する、システムに配信されます。匂いは〜1000ml/minの流量で空気を運んでタイゴンR - 3603真空チューブ（サンゴバン株式会社）を介して配信されます。チューブの着臭剤及び着臭剤の残留量との間の汚染を避けてください。利用可能な場合は、嗅覚刺激の再現性はcontroすることができます水素炎イオン化検出器（microFID 2020 Photovac）を使用してlled。
2. 光学設定がオンになっています。それは、蛍光実体顕微鏡（ライカMZ16）に関連付けられた12ビットCCDカメラ（ORCA AG浜松）、コンピュータ制御の嗅覚インターレースと適切なバンドパス干渉フィルターで励起ランプを安定冷却で構成されています。我々のセットアップを記述する方式を図2に示す。組み込み光信号用光ファイバリングの光（ショット）と結合イメージング（IOSI）、200Wタングステンハロゲンランプ（オリエQTHは）安定して均一な照明を提供するために使用される顕微鏡対物の周りに差し込ま。 5ミリメートルコア液体ライトガイドを持つためのフラビン自家蛍光シグナルイメージング（FASI）、150Wメタルハライドランプ（ライカ）は、実体顕微鏡の落射照明のポートを介して蛍光のにもローカライズされた励起を提供しています。

   画像収集とハードウェアの同期は、カスタムソフトウェアによって実現されています。オープンのゲート・ソーソフトウェアMicromanagerも光学セットアップと買収を制御するために使用することができます。

4。光学イメージング

1. 実体顕微鏡下で定位フレーム、視野の中心に頭蓋窓を（光学セットアップの概略図は図2Aを参照）に置きます。
2. 毛細血管に集中する顕微鏡をチューニングします。電球の刺激試験の前に（5の説明を参照してください）​​画像は、血管イメージングのための良好なコントラストを提供する560nm（緑）の光（ファイバリング）の下で撮影されている。この写真は準備の状態をチェックするために解剖学的コントロールとして使用され、実験中に複数回取得されます。
3. IOSのイメージングのために、光強度が630 + / -10ナノメートル（赤）照射下でCCDカメラによって記録され反映されます。画像は150msの程度の露光時間に相当する毎秒5フレームでフルフレーム（無ビニング）で取得されています。光源のパワーが再調整され OB領域で少なくとも約3000のACHグレーレベル、CCDピクセル井戸の飽和に近い。そうすることで、アクティベーション中にかすかな強度の変化を捕らえるためにCCDの12bitsのダイナミックスを活用することが可能になります。最大IOS振幅〜1％に達する。
4. FASイメージング蛍光のために480nmの励起+ / - 20nmの（青）epiflurorescence光の下で取得されます。 515nmでのハイパスフィルタは、光を取り込むように設定されています。画像は、感度を最大にするために4で4のビニングで毎秒5フレームで取得されています。励起光のパワーがOB区域に3000のグレーレベルとIOSと同様に調整されます。最大FAS振幅は〜3％に達する。

   両方の画像診断法の場合は、対象面に被写界深度は同じですと約4倍の倍率は0.5mm単位で測定した。

5. 光が加熱し、製剤の退色を避けるためにイメージングの臨床試験の間にオフにする必要があります。

ル"> 5。イメージングの臨床試験

1. 標準撮像セッションでは、空気のみが配信される10秒に5のベースラインを含め、さらにベースラインの回復のために一定の空気の流れ（ 図で記録されている選択された臭気濃度、および70 82sに応じて10秒〜3の匂い刺激が続く2A）。裁判の終了時に、ライトはオフになっており、純粋な空気が残留臭気の分子を洗い流すと感覚馴化を避けるために間トライアル間隔期間（1〜3分）のために配信されます。臭気試験はブランク試験（空気の配達）とインタリーブされた。
2. 臭気誘発活性化ゾーンは、マップ上でほぼ球状の領域として視覚化し、個々の糸球体の大きさ（直径⁹の80〜200μmの）に対応しています。画像処理は、図2Bに説明されています。嗅覚のマップを図3に示されている。他の感覚系に反して、OBの信号対雑音比は、（単一の試験で臭気誘発反応を解決するのに十分であった図。 IOSと図のための3B。 FASのための3D）。
3. マウスは実験動物の管理と使用のためのヨーロッパの勧告に従った方法を使用して、イメージングセッションの終了時に即座に安楽死されています。

6。代表的な結果（図3の嗅覚マップを参照してください）​​：

げっ歯類で主嗅球の1の構造の組織図 。嗅覚ニューロン、主嗅上皮にある一次感覚細胞は、同じ嗅覚受容体を発現し、OBで同じ糸球体に収束する。嗅覚糸球体、円形neuropilsは、（破線の円）、OBの表面に位置しています。非常に濃厚で複雑な血管網は糸球体のレベルで存在していることに注意してください。略語（上/下）：ONL：嗅神経層、GL：糸球体層、EPL：外部網状層、MCL：僧帽細胞層、GCL：顆粒細胞層。

図2反射率およびin vivoでの記録蛍光シグナル。 A.は、広視野光学イメージングセットアップ。麻酔マウスの脳は、光学レンズや顕微鏡の落射照明のポートに接続されているいずれかの環状の光ファイバリングを介して赤（IOS）または青（FAS）光のどちらかに公開されます。臭気は密封瓶にロードされ、odorized空気は動物の鼻に配信されます（緑色のライト：オープンバルブ）。 B.記録のプロトコルとデータ処理。 IOSおよびFASは、個々の試験の一連の（期間の90年代）として記録されます。図は、単一試行のタイムラインを示しています：ベースラインは、5から10秒、3から10秒への刺激、および70〜82sのベースラインに復帰して変化する。画像処理は、刺激期間中の強度値にベースライン時の輝度値のピクセル単位の減算（FAS用）Oが必要ですRの刺激に加えてベースラインに復帰（IOSの場合）。この違いは、（ 図で得られた画像を参照してください。3）％の変動を得るためにベースライン値で除算されます。

図3臭気誘発IOSおよびFASのイメージングを使用してOBで活動マップを。背OBのA.血管は緑の光の下で可視化した。 BC。 20％のヘキサナールの10秒プレゼンテーションのためのIOSイメージ化された（それぞれ3つの平均の試験に対して、単一の試験）。白い矢印は、この匂いによって活性化された関心の球状の領域を示している。これらのアクティベーションマップはフレームを使用して得られた匂いの刺激（反射率の変化で-0.63％とBで-0.52％の最大値）の終了後の最初の秒間の平均値。臭気の活性化が発生した吸光度の黒帯に注意してください。 CD。 FAS（3つの平均の試験のそれぞれに対して、単一の試験と同じ匂いのために同じマウスで連続的に取得LY）。これらのアクティベーションマップはフレーム匂い刺激の始まり（蛍光変化Dで0.72パーセントとEの0.66パーセントの最大）後の最初の秒間の平均値を用いて得られた。黒い矢印で示された自家蛍光発光の白帯はIOSで黒いゾーンに対応することに注意してください。 FASのマップで見られる粗い面は、感度の向上のために必要な4ビニングにより4によるものです。 FASの画像は、自家蛍光が漂白から修正されていない。画像の実際の寸法は0.7 mm幅× 1.2 mm長。

Discussion

この記事では、マウスのOBの臭い誘発活動のin vivoでの録音のためのIOSおよびFASイメージング技術を紹介。この目標を達成するために、比較的シンプルで手頃な広視野光学イメージングの設定が必要です。画像データの取得はうまく手術の手順を実行し、硬膜や脳組織への損傷を避けるために、トレーニングが必要です。特に、大出血は、イメージングのために記録された光子を吸収し、実験を終了します。

IOSおよびFASイメージングの利点の1つは、細胞毒性または望ましくない副作用を引き起こす可能性蛍光トレーサーの注入を避けるためです。彼らは嗅覚マップしたがって、感覚刺激の空間的なコーディングについての問題に取り組むことが可能となります。 2 - デオキシグルコースのイメージングに反して、彼らは一つの動物の画像、いくつかの匂いに可能性を提供しています。光子浸透が組織に限られているので、しかし、、IOSおよびFASは、OBの背の部分に制限されていますと腹側の領域から録音することはできません。

内因性光信号のイメージングは、in vivoイメージングのための優れた空間分解能を提供しています。反射率の血管コンポーネントの技術的な改良の懸念定量的な計算では、感覚の活性化¹⁰中^8,9だけでなく、血液の酸素化とボリュームのダイナミクスを通知します。 IOSイメージングアプローチの多波長イメージングは​​、現在、完全に感覚の活性化中にOBの総ヘモグロビン濃度と酸素を定量化するために我々の研究室で開発されています。 FASイメージングに追加これらの分光光学的測定は、感覚の活性化^11,12の間に血管や細胞内動態との間の未解決の関係に答える機会を提供します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer AG
Agarose, type III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Hexanal 98%	Aldrich	115606-100ML