Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em
Summary
Eine Methode zur organotypischen Slices aus dem E12.5 murinen embryonalen Mittelhirns zu erzeugen, ist beschrieben. Die organotypischen Kulturen verwendet, um das Verhalten von dopaminergen Neuronen oder anderen ventralen Mittelhirn Nervenzellen zu beobachten.
Abstract
Die Maus ist ein ausgezeichnetes Modell Organismus von Säugetieren die Entwicklung des Gehirns aufgrund der Fülle von molekularen und genetischen Daten zu studieren. Allerdings ist die Entwicklung von Gehirn der Maus nicht für einfache Handhabung und Bildgebung in vivo geeignet, da die Maus-Embryo ist unzugänglich und undurchsichtig. Organotypischen Kulturen von embryonalen Gehirne sind daher häufig verwendet, um murine die Entwicklung des Gehirns in-vitro-Studie. Ex-vivo Manipulation oder die Verwendung von transgenen Mäusen ermöglicht die Änderung der Genexpression, so dass Subpopulationen von Neuronen oder Gliazellen mit fluoreszierenden Proteinen markiert werden können. Das Verhalten der markierten Zellen können dann beobachtet, wenn Zeitraffer-Bildgebung werden. Zeitraffer-Bildgebung hat sich besonders zur Untersuchung von Zell Verhaltensweisen, die die Entwicklung der Hirnrinde am späten embryonalen Stadien 1-2 zugrunde liegen. Embryonale organotypischen Kultur-Systemen im Gehirn Regionen außerhalb des Vorderhirns sind weniger gut established. Daher ist der Reichtum der Zeitraffer-Imaging-Daten zur Beschreibung neuronaler Zellmigration auf das Vorderhirn 3,4 beschränkt. Es ist noch nicht bekannt, ob die Grundsätze für die dorsale Gehirn entdeckt wahr halten ventralen Hirnbereiche. In der ventralen Gehirn sind Nervenzellen in neuronalen Clustern statt Schichten organisiert und sie haben oft zu kompliziert wandernde Bahnen zu unterziehen, um ihre endgültige Position zu erreichen. Die ventralen Mittelhirn ist nicht nur ein gutes Modell für ventrale Entwicklung des Gehirns, sondern enthält auch neuronale Populationen wie dopaminergen Neuronen, die relevant sind in Krankheitsprozesse. Während die Funktion und die Degeneration von dopaminergen Neuronen ist sehr detailliert in das erwachsene und alternde Gehirn untersucht worden, ist nur wenig über das Verhalten dieser Neuronen während ihrer Differenzierung und Migration Phase 5 bekannt. Wir beschreiben hier die Generation der Scheibe Kulturen aus dem embryonalen Tag (E) 12,5 Maus ventralen Mittelhirn. Diese Scheibe Kultnahmen sind potentiell geeignet für die Überwachung der dopaminergen Neuronen Entwicklung über mehrere Tage in vitro. Wir beleuchten die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von Hirnschnitten in diesen frühen Stadien der embryonalen Entwicklung und besprechen die notwendigen Voraussetzungen für die Aufrechterhaltung der normalen Entwicklung von dopaminergen Neuronen in vitro. Wir präsentieren auch Ergebnisse aus Zeitreihen Imaging Experimente. In diesen Experimenten wurden ventralen Mittelhirn Vorstufen (einschließlich dopaminerge Vorstufen) und ihre Nachkommen in einem Mosaik Weise unter Verwendung eines Cre / loxP Basis induzierbaren Schicksal Mapping-System 6 gekennzeichnet.
Protocol
Discussion
Die organotypischen Kultur hier vorgestellte Methode stellt ein System für die kurzfristige In-vitro-Analyse der Entwicklung von dopaminergen Neuronen und ihre Migrations-und Projektions-Strecken in der embryonalen ventralen Mittelhirn. Wir fanden, dass es eine Reihe von kritischen Schritte in das Protokoll, das sorgfältig gepflegt werden sollte, um Scheiben, die die normale Entwicklung des ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen ermöglichen zu erhalten. Der wichtigste Schritt ist die Zerlegung des embryo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Martine Emond und Isabel Brachmann für ihre Hilfe bei der Festlegung der organotypischen Kultur und Wolfgang Hübner und Liviu Gabriel Bodea für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten Frank Costantini für die R26-Reporter Mäusen und Cliff Tabin für die Shh Creer Mäuse danken. Diese Studie wurde durch einen Forschungspreis aus dem Ministerium für Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen (Programm zur förderung der Rückkehr des Wissenschaftlichen Spitzennachwuchses Aus dem Ausland) gefördert.
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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