تصور انواع معينة ايليجانس استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان
Summary
نقدم طريقة لتصور العيش في إهاب<em> C. ايليجانس</em> باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl – 3 ، 3،3' ، 3' – tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في<em> C. ايليجانس</em> لتصور العصبونات المعرضة بيئيا. مع هذا البروتوكول الأمثل ، وجناح الكبير الملون والحلقي هياكل جليدية بواسطة الجاذبة ولاحظ باستخدام المجهر المركب.
Abstract
إهاب من C. ايليجانس هو بنية شديدة المقاومة التي تحيط الخارجي للحيوان 1-4. إهاب لا يحمي فقط من الحيوان والبيئة ، ولكن كما يحدد شكل الجسم ويلعب دورا في حراك 4-6. عدة طبقات يفرز من قبل خلايا البشرة تتكون من إهاب ، بما في ذلك طبقة الدهون الأبعد 7.
دعا التلال كفافي في إهاب للحلقة نمط طول الحيوان وموجودة في جميع مراحل التنمية 8. أجنحة هي التلال الطولية التي موجودة خلال مراحل معينة من التنمية ، بما في ذلك L1 ، dauer ، ومراحل البالغين 2،9. يمكن أن الطفرات في الجينات التي تؤثر على المنظمة جليدية تغيير بنية الكولاجين جليدية والحيوان التشكل 5،6،10،11 الجسم. بينما التصوير المجهري باستخدام جليدية مجمع مدينة دبي للإنترنت مع البصريات هو ممكن ، الطرق الحالية التي تبرز هياكل جليدية تشمل fluores12 في المائة التحوير التعبير ، وتلطيخ الضد 13 ، والمجهر الإلكتروني 1. جرثومة القمح المسمى راصة (WGA) كما تم استخدامها لتصور جليكوبروتينات جليدية ، ولكن محدودة في حل هياكل جليدية الدقيقة 14. وقد لوحظ تلون سطح جليدية باستخدام صبغة الفلورسنت ، ولكن لم تتميز بالتفصيل 15. نقدم طريقة لتصور العيش في C. إهاب ايليجانس باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl – 3 ، 3،3' ، 3' – tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في C. ايليجانس الخلايا العصبية لتصور المعرضة بيئيا. هذا البروتوكول الأمثل لتلطيخ الجاذبة هو بسيط ، طريقة قوية لرؤية ارتفاع القرار من الفلورسنت للحلقة ، جناح الكبير والفرج ، وذيل الذكور ، وارتفاع الذيل خنثى في C. ايليجانس.
Protocol
Discussion
طريقة تلوين الجاذبة المقدمة هنا يسمح للطريقة سريعة ومريحة نسبيا لتصور في إهاب ايليجانس جيم. بواسطة repurposing وتحسين طريقة تستخدم عادة لصورة الخلايا العصبية الحسية 15،17 المعرضة بيئيا ، يمكن أن تستخدم لصبغ الجاذبة fluorescently كلا أجنحة وهياكل حلقية (الشكلان 1 و 2) ، ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر S. تانيجا – Bageshwar ، Beifuss K. ، Kedroske S. ، والمراكز الصحية. هسياو للمناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق بدء الأموال من وزارة TAMHSC الطب الجزيئي والخلوي. تم شراؤها في نطاق المجمع والقرص الغزل مع الأموال المقدمة من قبل الدائرة ومكتب TAMHSC عميد. وقدمت بعض سلالات من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة ، والذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد. وكان pRF4 (رول – 6 (su1006)) هدية من الحرائق أ.
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. . C. elegans Atlas. , (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. 유전학. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77, 71-94 (1974).
