Avslöja Neural Circuit Topografi i flera färger
Summary
Vi erbjuder en praktisk guide för att leverera spårämnen<em> In vivo</em> Och använder Spinocerebellar väg som modellsystem för att visa viktiga steg för en lyckad neuronala kretsar analys på möss. Vi beskriver i detalj vårt mångsidiga spåra protokoll som utnyttjar vetegroddar agglutinin (WGA) konjugerat till Alexa fluoroforer.
Abstract
Nervbanor är organiserade i funktionella topografiska kartor. För att visualisera komplexa kretsar arkitektur vi utvecklat en metod att på ett tillförlitligt märka globala mönstring av flera topografiska prognoser. Lillhjärnan är en idealisk modell för att studera ordentlig ordning på neurala kretsar. Till exempel har kompartment organisation Spinocerebellar mossiga fibrer visat sig vara ett oumbärligt för att studera mossiga fiber mönstring. Vi visade nyligen att vetegroddar agglutinin (WGA) konjugerat till Alexa 555 och 488 kan användas för att spåra Spinocerebellar mossiga fiber projektioner för att utveckla och möss vuxen (Reeber et al. 2011). Vi har hittat tre stora egenskaper som gör att WGA-Alexa spårämnen önskvärt verktyg för märkning neurala prognoser. Först Alexa fluoroforer är intensiva och deras ljusstyrka tillåter wholemount bildbehandling direkt efter spårning. För det andra, etikett WGA-Alexa spårämnen hela banan för att utveckla och vuxna neurala projections. Tredje WGA-Alexa spårämnen snabbt transporteras i både retrograd och anterograd riktningar. Här beskriver vi i detalj hur man förbereder de spårämnen och andra verktyg som krävs, hur man utför kirurgi för Spinocerebellar spåra och hur man bäst bild spåras prognoser i tre dimensioner. Sammanfattningsvis ger vi en steg-för-steg spåra protokoll som kommer att vara användbart för att dechiffrera organisation och anslutning av funktionella kartor inte bara i lillhjärnan, men också i hjärnbarken, hjärnstammen och ryggmärgen.
Protocol
Discussion
Vi har beskrivit de kirurgiska och tekniska uppgifter som krävs för en lyckad axonal och Dendrite spåra med hjälp av en ny fluorescerande metod för att snabbt märkning neurala prognoser för att utveckla och möss vuxen. Använda WGA-Alexa visar vi hur spårämnen och markörer kan användas för att analysera mönstrade krets topografi med hög upplösning och i tre dimensioner.
Många spårämnen finns för att spåra neuronala kretsar, inklusive koleratoxin subenhet B, Biocytin, Neu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av nya utredare start medel från Albert Einstein College of Medicine i Yeshiva University till RVS.
Materials
| Equipment/Reagents | Model/Catalogue number | Company |
| Bead sterilizer | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | Fine Science Tools |
| Cauterizer | Cat. # 18000-00 | Fine Science Tools |
| Borosilicate glass capillaries | Cat. # 300056 | Harvard Apparatus |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Model 001-PC-10 | Narishige |
| Micrometer syringe | Cat. # GS-1100 | Gilmont Instruments |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Model 940-A | Kopf Instrumentation |
| Electrode Manipulator | Model 960 | Kopf Instrumentation |
| Vetcare chamber | Cat. # 340508 | Harvard Apparatus |
| Heating Pad | Cat. # 341241 | Harvard Apparatus |
| Leica DFC360 FX camera | DFC360 FX | Leica |
| Leica DFC490 camera | DFC490 | Leica |
| Leica DM5500 microscope | DM5500 | Leica |
| Leica DFC3000 FX camera | DFC3000 FX | Leica |
| Leica MZ16 FA microscope | MZ16 FA | Leica |
| CY3 Filter | Model # 11600231 | Leica |
| FITC Filter | Model # 11513880 | Leica |
| A4 DAPI/UV filter | Model # 11504162 | Leica |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Cat. #W11261 | Invitrogen |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Cat. #W32464 | Invitrogen |
References
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. . Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. 신경과학. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
