מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים
Summary
γ-Herpesviruses (γ-HVs) להקים לאורך החיים התמדה ב המארח שלהם. זיהום של עכברים עם γ-HV68 מספק ממושמע גנטית<em> In vivo</em> מודל לאפיון של מחזור החיים / בפתוגנזה של γHVs. פרוטוקול זה מתאר את גילוי quantitation של זיהום γHV68 בשלבים חריפה בעקבות זיהום לטנטי על ידי המרכז, פלאק יוצרי זיהומיות, מבחני qPCR.
Abstract
γ-Herpesviruses (γ-HVs) בולטים על יכולתם להקים זיהומים סמויה של תאים הלימפה 1. טווח צר של האדם המארח γ-HVs, כגון EBV ו KSHV, יש הפריע קשות מחקרים פתוגניים מפורט. Murine γ-ההרפס 68 (γHV68) מניות דמיון גנטי וביולוגי נרחב עם אדם γ-HVs והוא הפתוגן טבעית של מכרסמים murid 2. לפיכך, ההערכה של זיהום γHV68 של עכברים זנים טהורים בשלבים שונים של זיהום ויראלי מספק מודל חשוב להבנת מחזור בפתוגנזה נגיפיים במהלך זיהום γ-HVs.
לאחר חיסון intranasal, γHV68 תוצאות זיהום viremia חריפה בריאה כי נפתרה מאוחר יותר לתוך זיהום לטנטי של splenocytes ותאים אחרים, אשר עשוי להיות מחדש לאורך חיי לארח את 3,4. בפרוטוקול זה, נתאר כיצד להשתמש assay פלאק על התחתכייל של וירוס מדבק בריאה homogenates על monolayers תא Vero בשלב מוקדם (5 – 7 ימים) של זיהום שלאחר intranasal (dpi). בזמן זיהום חריף מנוקה ברובו 2-3 postinfection שבועות, זיהום לטנטי של γHV68 מוקמת סביב 14 dpi ומתוחזק בהמשך בטחול של העכברים. זיהום לטנטי בדרך כלל משפיע על אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים ברקמות נגועות, לפיו הנגיף נשאר רדום ומכבה ביותר של ביטוי גנים שלה. Splenocytes רדום נגועים בנגיף באופן ספונטני מחדש על explanting בתרבות רקמות, אשר יכול להיות סיכם על ידי assay זיהומיות (IC) המרכז כדי לקבוע את עומס ויראלי סמוי. כדי להמשיך להעריך את כמות העותקים של הגנום הנגיפי בחריפות ו / או רקמות נגועות רדום, כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) משמש הרגישות המקסימלית שלה ואת הדיוק. מנתח בשילוב של תוצאות assay qPCR ורובד, ו / או assay IC יחשפו את הפרופילים spatiotemporal של נגיפישכפול infectivity in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 כבר בשימוש נרחב כמודל להבין את הפתוגנזה של 2,4,5 אדם γ-HVs. בפרוטוקול זה, אנו תיאר שלוש שיטות בשימוש שגרתי, כולל assay פלאק עבור כייל הנגיף מדבק, assay IC עבור עומס ויראלי סמוי, ועל qPCR עבור עומס הגנום הנגיפי, כדי להעריך את זיהום חריף הכמוס של γHV68 לאחר חיסון intranasal בעכברים….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר ייעוץ טכני ותמיכה רן Sun (אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס) ו Seungmin הוואנג (אוניברסיטת וושינגטון). עבודה זו מומנה על ידי קרן בקסטר, המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (R01 ו – R21 CA140964 AI083841 אל ג ליאנג).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
References
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
