Meting van γHV68 infectie in Muizen
Summary
γ-herpesvirussen (γ-HVS) het vaststellen van een leven lang persistentie in hun gastheer. Infectie van muizen met γ-HV68 biedt een genetisch handelbaar<em> In vivo</em> Model voor de karakterisering van de levenscyclus / pathogenese van γHVs. Dit protocol beschrijft de detectie en kwantificering van γHV68 infectie bij acute en latente fase na infectie door plaque-forming, aanstekelijke centrum en qPCR assays.
Abstract
γ-herpesvirussen (γ-HVS) zijn bekend om hun vermogen om latente infecties van lymfoïde cellen 1 vast te stellen. De smalle gastheer bereik van het menselijk γ-HVS, zoals EBV en KSHV, ernstig heeft gehinderd gedetailleerde pathogene studies. Murine γ-herpesvirus 68 (γHV68) aandelen uitgebreide genetische en biologische overeenkomsten met menselijke γ-HVS en is een natuurlijke ziekteverwekker van murid knaagdieren 2. Als zodanig, de evaluatie van γHV68 infectie van de muizen inteeltstammen in verschillende stadia van virale infectie geeft een belangrijk model voor het begrijpen van virale levenscyclus en pathogenese tijdens γ-HVS infectie.
Na intranasale inoculatie, γHV68 infectie resulteert in een acute viremie in de longen, dat is later opgelost in een latente infectie van splenocyten en andere cellen, die kunnen worden gereactiveerd gedurende de gehele looptijd van de gastheer 3,4. In dit protocol beschrijven we hoe de plaque assay te gebruiken om te beoordelens besmettelijke virus titer in de longen homogenaten op Vero cel monolagen aan het vroege stadium (5 – 7 dagen) van het post-intranasale infectie (dpi). Terwijl de acute infectie is grotendeels geklaard 2 – 3 weken postinfection, een latente infectie van γHV68 is gevestigd rond 14 dpi en onderhouden later in de milt van de muizen. Latente infectie treft meestal een zeer kleine populatie van cellen in de geïnfecteerde weefsels, waardoor het virus blijft latent en schakelt de meeste van zijn genexpressie. Latent-geïnfecteerde splenocyten spontaan activeren virus bij explanting in weefselkweek, die kan worden samengevat door een besmettelijk centrum (IC) test aan de viral load latente bepalen. Om verder het aantal virale genoom exemplaren raming in de acute en / of latent geïnfecteerde weefsels, kwantitatieve real-time PCR (qPCR) wordt gebruikt voor de maximale gevoeligheid en nauwkeurigheid. De gecombineerde analyse van de resultaten van qPCR en plaque assay, en / of IC-test zal onthullen de spatiotemporele profielen van viralereplicatie en infectiviteit in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 is op grote schaal gebruikt als een model om de pathogenese van de menselijke γ-HVS 2,4,5 te begrijpen. In dit protocol beschreven we drie routinematig gebruikte methoden, waaronder plaque assay voor besmettelijke virus titer, IC-test voor latente viral load, en qPCR voor virale genoom belasting, om de acute en latente infectie van γHV68 te evalueren na intranasale inoculatie bij muizen.
De plaque assay wordt veelvuldig gebruikt om het virus titer in geïnfecteerde cellen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag aan de technische advisering en ondersteuning van Ren zon (University of California, Los Angeles) en Seungmin Hwang (Washington University) te erkennen. Dit werk werd gefinancierd door de Stichting Baxter, National Institutes of Health subsidies (R01 CA140964 en R21 AI083841 naar C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
References
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
